Ex vivo doorbloeding van de knaagdieren placenta

Alle experimentele procedures werden goedgekeurd door de instelling van het Comité van de Dierenzorg en het gebruik van de Universiteit Rutgers. 1. voorbereiding voor het experiment Opmerking: deze stappen kunnen worden uitgevoerd binnen dagen/weken voorafgaand aan het experiment. De schip kamer te wijzigen.Opmerking: Figuur 1a, B toont de gewijzigde enkele schip kamer. Verplaats de thermistor sensor van onder de clip en buig het zodat deze vrij in het bad van de bloed doorbloeding hangt (Figuur 1b). Installeer twee 4-inch stompe-Tip roestvrijstalen naalden met standaard Luer-aansluiting hubs, 1 25 G en 1 23 G beveiligd onder de thermistor clip en voeg een 3-weg wegkraan toe te staan voor canulatie van de navel vasculatuur (Figuur 1b).Opmerking: de Luer aansluitingen van verschillende maten zijn kleur gecodeerd. Dit vergemakkelijkt de identificatie van vaartuigen tijdens en na het experiment. Installeer twee 70 − 100 µm glazen micropipetten. Raadpleeg voor meer informatie over deze procedures de volgende verwijzingen10,11.Opmerking: de tip diameter vaak gebruikt in deze experimenten is in het bereik van 70 − 100 µm. Tip diameters groter dan dit bereik kan moeilijkheid toe te voegen aan het canulatie proces, terwijl Tip diameters kleiner dan 60 µm kan punctie de vaatwand tijdens canulatie. Bereid banden van steriele nylon hechting (voor proximale en distale uiteinden van de baarmoeder slagader) en van zwart gevlochten zijde niet-steriele hechting (voor de navelstreng schepen). Maak enkele banden door lus hechting als een vierkante knoop te starten of een schoen te binden, zoals eerder beschreven11.Opmerking: enkele banden worden vaak gemaakt en bewaard in een Petri schaaltje gevuld met een kleine laag van siliconen rubber te helpen werken op een kleverige achtergrond. Bereid 2 L fysiologische zoutoplossing (PSS) voor die, in mmol/L, 129,8 NaCl, 5,4 KCl, 0,5 NaH2po4, 0,83 MgSO4, 19 NaHCO3, 1,8 CaCl2, en 5,5 glucose. Pas de pH aan 7,40 ± 0,02 door langzaam toe te voegen een paar druppels zuur (1 M zoutzuur) of Base (1 N natriumhydroxide) aan de oplossing en wacht ten minste 20 s voor het lezen van de aangepaste pH-meting. Store PSS tot klaar voor gebruik in de koelkast om verontreiniging te verminderen, maar niet op te slaan voor meer dan 2 weken. Label microcentrifuge tubes voor het verzamelen van “moeders” en “foetale” effluenten op elk tijdstip, dat wil zeggen, “MBaseline, M10, M20,…” tot 180 min timepoint. Bereid hetzelfde voor op foetale effluenten (FBaseline, M10, M20,….). Kalibreer alle apparatuur die wordt gebruikt in het systeem, met inbegrip van de circulerende Bad temperatuur en bloeddrukmeters in verband met het behoud van de baarmoeder (80 mmHg) en de navelstreng (50 mmHg) perfusaat druk. Bereid een dissectie kamer (4 “diameter x 1” diep) of een circulerende kachel schotel door het vullen van een laag (< 0,25 ") van siliconen rubber. Deze wijziging moet vooraf worden gedaan en als het duurt 12 − 24 uur voor de rubber te drogen.Opmerking: het gebruik van een Recirculerende kachel/koeling schotel wordt aanbevolen voor beginnende chirurgen, als de schotel zal niet bewegen en het weefsel zal een consistente temperatuur te handhaven. 2. voorbereiding van het chirurgisch station en evenwicht van apparatuur Zet alle apparatuur die het transfusie systeem ondersteunt om te controleren of de juiste functie. Verwijder de PSS van de koeling en warm tot kamertemperatuur. De PSS wordt gebruikt als een perfusaat en een superfusate. Plaats een kleine borrelende steen om een gasmengsel in het superfusate reservoir te leveren. Veelgebruikte mengsels zijn 21% O2, 8% o2, 3% o2, en 0% o2. Zet het gas om kleine bubbels te bieden aan de superfusate oplossing. Pas de levering van gas om spatten te voorkomen. Schik de dieren ontleden station door het controleren van verdoving, het regelen van chirurgische apparatuur, en de voorbereiding hechting banden. Bereid het ontleden van de kamer door het verzamelen van ontleden pennen, draaien op de Chiller (of het ophalen van ijs), en het vullen van de ontleden kamer (bekleed met rubberen siliconen) met koude PSS. Vul alle kamers, naalden, glazen micropipetten, slangen en reservoirs met verwarmde PSS, zorgvuldig te kijken voor en het elimineren van luchtbellen door zuigen ze uit met een fijne tip Transfer pipet. Draai alle 3-weg gasmonster tot drieweg met “uit” tegenover de richting van de pipet om de vloeistof in de pipet te beveiligen. Plaats een enkele stropdas op elk van de twee glazen micropipetten voorbereid voor de baarmoeder canulatie en op de twee stompe Tip naalden aangewezen voor de navelstreng canulatie. Veilige banden met de pipetten en stompe Tip naalden om verlies tijdens kamer bewegingen te voorkomen (figuur 1c). 3. het oogsten van de placenta Verdoven een zwangere vrouwelijke rat op zwangerschapsduur dag 20 met 5% Isofluraan voor ongeveer 4 min of totdat het dier tentoongestelde voorwerpen gezwoegd ademhaling. Verplaats het dier naar de neuskegel en het beheer van 2,5% − 3% Isofluraan om anesthesie te handhaven. Bevestig bewusteloosheid door een gebrek aan teen pinch reflex.Opmerking: het gebruik van een rat op zwangerschapsduur dag 20 wordt gepresenteerd in dit protocol. Echter, het Protocol blijft hetzelfde als experimentele voorwaarden vereisen placentale evaluatie plaats te vinden eerder in de dracht. Identificeren en isoleren van de baarmoeder hoorn (rechts of links) van de keuze door het optillen en verspreiden van lange manieren buiten de rat karkas. Met behulp van een gevlochten zijden hechtdraad, Das uit de baarmoeder slagader aan de eierstokken einde en vaginale einde van de hoorn. Omvatten de eierstokken binnenkant van de hechting met de baarmoeder hoorn. Met behulp van chirurgische schaar, accijns weg de baarmoeder hoorn door het maken van bezuinigingen op de proximale kant van de eierstokken stropdas en distale kant van de vaginale stropdas, waardoor de baarmoeder hoorn afgebonden met de hechtingen aan beide uiteinden. Breng de baarmoeder hoorn in de ontleden schotel bekleed met siliconen rubber en gevuld met koude (4 °C) PSS. Ongeacht of de rechter of linker hoorn is gekozen, handhaven die dezelfde kant voor de selectie in elk experiment voor consistentie.Opmerking: voor foetale anesthesie worden pups in ijskoude PSS gehouden. Daarom wordt de PSS temperatuur in de ontleden kamer onderhouden door gekoeld Circulerend bad of ontleden kamer moet worden gehouden op ijs.Opmerking: op dit punt verdoofd dam kan worden euthanized per laboratorium dec protocol goedkeuring. In dit geval, euthanasie gebeurt via pneumothorax (door het snijden van het middenrif) en de verwijdering van het moeders hart. Duw voorzichtig een ontledende pin door de baarmoeder hoorn in de siliconen rubber, met de eierstokken kant naar links en vaginale kant naar rechts om de baarmoeder vasculatuur te visualiseren. Dit zal stabiliseren de baarmoeder en het voorkomen van beweging van het weefsel tijdens dissectie van de foetale compartiment. Selecteer een moeder-placenta-foetale eenheid centraal in de hoorn en binden de baarmoeder slagader en ader met chirurgische schaar. Snijd de baarmoeder spier proximale en DISTAAL aan de geselecteerde placenta en foetus. De baarmoeder spier kan worden ingetrokken door te trekken naar de zijkant; het is belangrijk om het intact te laten, maar weg te trekken uit de dekking van de foetale pup.Opmerking: selectie van de moeder-placenta-foetale eenheid moet worden gebaseerd op de lengte van de baarmoeder slagader segment aan beide zijden van de gebogen slagader. Langere segmenten zal toelaten meer succesvolle canulatie. Gebruikend fijne Tang en schaar, verwijder het vrucht vlies van de foetale oppervlakte van de placenta, die zorg neemt om de navelstreng te vermijden. Ontrafel en binden de navelstreng om de foetale pup te scheiden. Identificeer de navelstreng slagader (dikkere vaartuig) en ader (dunnere vaartuig). Markeer de navelstreng voor eenvoudige identificatie door het te snijden iets korter dan de navelstreng slagader. Zachtjes scheiden de navelstreng slagader en ader van elkaar. De gehele placenta-eenheid met inbegrip van de baarmoeder vasculatuur, baarmoeder spier, placenta, en de navelstreng, kunnen worden gesneden en verwijderd. 4. placentale doorbloeding Handhaven anatomische bloedstroom behoud van de juiste distale-naar-proximale oriëntatie van de baarmoeder slagader, plaats de placenta-eenheid (samengesteld uit de baarmoeder vasculatuur, baarmoeder spier, placenta, en de navelstreng) in de gewijzigde geïsoleerde schip kamer gevuld met een warme, zuurstofrijk PSS. Met behulp van een paar fijne Tang in elke hand, cannulate de proximale en distale uiteinden van de baarmoeder slagader op het glas micropipetten. Stevig veilig de baarmoeder slagader met behulp van de steriele nylon hechting band eerder bevestigd op de micropipet.Opmerking: twee-tie lussen (knoop) kan nodig zijn; echter, een enkele tie lus zorgt voor een grotere aanpassing. Cannulate de navelstreng (foetale-aan-moederbloed stroom) op de 23 G (grotere) naald en Beveilig het met zwarte gevlochten zijde hechting. Cannulate de navelstreng (moeder-naar-foetale bloedtoevoer) op de 25 G (kleinere) botte naald en veilig met zwarte gevlochten zijde hechting. Verplaats naar de placenta en aanvulling alle gasmonster tot drieweg en slangen om luchtbellen te voorkomen. Sluit alle slangen volgens Figuur 2. Plaats kleine weeg boten onder de distale canulatie van de moeder baarmoeder slagader en de naald canulatie van foetale navelstreng om het effluent dat zal ontstaan tijdens de procedure te vangen. Zet de peristaltische pomp, drukregelaar, en de druk monitor en open de wegkraan om vloeistof stroom door de slang in de richting van de druk transducer, maar nog niet aan de placenta. Verhoog langzaam de druk tot 80 mm Hg. Langzaam draai de wegkraan naar de placenta te openen en te kijken voor lekken in de kamer en rond de banden.Opmerking: als de peristaltische pomp draait op een hoge snelheid, opnieuw evalueren van de proximale baarmoeder canulatie en banden voor vloeistof lekken. Indien geïdentificeerd, moeten lekken worden verholpen. Merk ook op, terwijl de gemiddelde baarmoederslagader druk constant zal blijven (ingesteld op 80 mmHg), de vloeistof debiet kan variabel zijn afhankelijk van de vasculaire en placenta fysiologische reacties. Kwantificering van de vloeistof stroom kan worden geïdentificeerd als een experimentele variabele in reactie op xenobiotische blootstelling. Draai de wegkraan om vloeistof stroom in de navelstreng slagader mogelijk te maken. Zet de druk op ongeveer 50 mmHg, die kan worden uitgevoerd met een peristaltische pomp (Figuur 3) of een hydrostatische kolom. Vul alle reservoirs (baarmoeder, navelstreng, en superfusate) om vocht volume te handhaven gedurende het experiment.Opmerking: zodra de doorbloeding is geïnitieerd en experiment is aan de gang, verdoofd pups nog in het ontleden gerecht kan worden beoordeeld op levensvatbaarheid door het aanraken van de pups met een tang om een neurologische reactie te lokken. Exsanguination van de pups zal plaatsvinden door middel van hysterectomie van de baarmoeder hoorn; de verdere euthanasie kan door goedgekeurde dec protocollen worden voltooid. In dit geval, het openen van het vruchtwater sac in de koude PSS en het creëren van een pneumothorax door het snijden van de ribben. 5. mock experiment Na canulatie en initiatie van de PSS-bloeding, laat weefsels equilibrate gedurende 30 minuten om de vasculatuur aan te passen aan de nieuwe vloeistof stroom. Zuig het effluent door een pipet en sla het op in een overeenkomstige gelabelde micro centrifugebuis. Na evenwicht, vast te stellen de baseline bloeding door het verzamelen van effluenten voor 10 min van beide wegen boten in microcentrifuge buizen en het meten van het volume van de vloeistof die naar voren komt door de baarmoederslagader en de navelstreng. Initiëren sample collectie met intervallen van 10 minuten door het verzamelen van de effluenten uit de distale baarmoeder slagader en de navelstreng ader. Bijvoorbeeld, het beheer van een 900 µ L bolus dosis van 20 nm Rhodamine-gelabelde polystyreen nanodeeltjes (8 x 1014 deeltjes/ml) geschorst in 0,01% oppervlakteactieve stof aan de lijn perfusing de baarmoeder slagader te identificeren de tijd cursus passage van xenobiotische nanodeeltjes over de placenta barrière.Opmerking: deze effluent monsters zal zorgen voor de meting van verontreinigende stoffen in de vloeistof (hetzij xenobiotische, farmacologische, of metaboliet) en bieden de snelheid van de vloeistof door de baarmoederslagader of over de placenta en in de foetale compartiment ( Figuur 4). Na bolus infusie, verzamelmonsters van de distale baarmoeder slagader en foetale navelstreng effluent elke 10 min voor een totaal van 180 min na infusie. 6. reiniging van de apparatuur Na elk experiment, verwijder de placenta-eenheid uit de pipetten. Alle hechtingen kunnen worden opgeslagen om te worden hergebruikt in toekomstige experimenten. Het placentale weefsel kan worden opgeslagen voor extra histologische of mechanistische studies. Reinig alle slangen en canules van het doorbloedings systeem met 70% ethanol gevolgd door gedistilleerd water en vacuüm droog.Opmerking: als slangen of pipetten beginnen te verkleuren of beschadigd lijken, vervang dan voorafgaand aan het volgende experiment. Verder, na een experimentele cohort is voltooid (bijv. alle studies met betrekking tot een enkele verontreiniging), vervangt alle buizen in de kamer om kruisbesmetting te voorkomen.