In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones In Vitro

L’ubiquitination est l’une des modifications post-traductionnelles les plus conservées et est essentielle pour une grande variété d’organismes, y compris la levure, les plantes et les vertébrés. L’ubiquitination consiste en l’attachement covalent de l’ubiquitine, un polypeptide d’acide aminé hautement conservé 76, pour cibler les protéines et se produit en trois étapes séquentielles impliquant trois enzymes, c’est-à-dire E1-activation, E2-conjugué et E3 ligase^{1, 2,3}. Cette modification post-traductionnelle joue un rôle central dans un large éventail de processus biologiques. En effet, les ligases E3, qui fournissent la spécificité de la réaction, constituent une grande superfamille d’enzymes et sont les enzymes les plus abondantes du système d’ubiquitine^4,5,6. Les effets en aval de l’ubiquitination des protéines dépendent de la nature de la modification : monoubiquitination, multi-monoubiquitination et polyubiquitination linéaire ou ramifiée. La monoubiquitination est rarement associée à la dégradation protéasomal, mais au lieu de cela cette modification est impliquée dans la médiation de divers événements de signalisation. La polyubiquitination implique le N-terminal ou les résidus de lysine dans la molécule d’ubiquitine elle-même, et le destin d’une protéine polyubiquitinated dépend de quel résidu est impliqué dans l’extension de la chaîne d’ubiquitine. On sait depuis longtemps que la polyubiquitination médiée par la lysine 48 de l’ubiquitine induit une dégradation protéasomale. Au contraire, la polyubiquitination par lysine 63 de l’ubiquitine est souvent associée à l’activation des protéines^7,8,9. Semblable à d’autres modifications post-traductionnelles importantes, l’ubiquitination est réversible et l’élimination de l’ubiquitine des protéines est assurée par des protéases spécifiques appelées deubiquitinases (DUB), qui ont émergé comme régulateurs importants des processus cellulaires ^{2 (en) , 10}. Fait important, de nombreux DUB sont hautement spécialisés, et régulent, par la déubiquitination, des substrats spécifiques, ce qui indique qu’un équilibre fin entre l’ubiquitination et la deubiquitination est essentiel pour la fonction protéique. Les E3 et les DUB, ainsi que les machines de dégradation protéasome et les facteurs accessoires, forment le système de protéasome d’Ubiquitin (UPS, avec les gènes de ‘1200) qui règle les voies de signalisation principales, dont plusieurs sont associées à la croissance et à la prolifération cellulaires, détermination du destin cellulaire, différenciation, migration cellulaire et mort cellulaire. Fait important, la déréglementation de plusieurs cascades de signalisation impliquant l’ubiquitination favorise la tumorigénèse et les maladies de neurodégénérescence^{5,11,12,13, 14}.

L’ubiquitination joue un rôle omniprésent dans la biologie de la chromatine et les processus dépendants de l’ADN^15,16,17. Par exemple, la monoubiquitination de l’histone H2A sur la lysine 119 (ci-après H2A K119ub) est une modification post-traduction essentielle impliquée dans la répression transcriptionnelle et la réparation de l’ADN^{18,19,20, 21,22}. H2A K119ub est catalysé par le Polycomb Repressive Complex 1 (PRC1), qui joue un rôle clé dans le maintien de l’information épigénétique et est fortement conservé de Drosophila à l’homme. Canonical PRC1 est constitué notamment par le RING1B et BMI1, qui sont le complexe de base E3 ubiquitin ligase responsable de l’événement d’ubiquitination mentionné ci-dessus^22,23. Dans Drosophila, La monoubiquitination H2A (H2A K118ub qui correspond à H2A K119ub chez les mammifères) est inversée par le DUB Calypso, qui interagit avec Le Comb sexuel supplémentaire (ASX) formant le polycomb-répressif DUB (PR-DUB) complexe²⁴. L’ortholog mammifère de calypso, BAP1, est un suppresseur de tumeur supprimé ou inactivé dans diverses malignités humaines^{25,26,27,28, 29} Ans et plus ^{, 30 Ans,} états-unis ( ^{, 31 Ans,} états-unis ( ^{, 32 Ans,} états-unis ( ^{, 33}. BAP1 régule les processus dépendants de l’ADN dans le noyau et l’apoptose à médiation calcique à l’endoplasmique^33,34,35,36 ,^{36, 37 Ans,} états-unis ( ^{, 38 Annonces , 39} Ans et plus qu’ils ^{, 40 ans,} états-unis ( ^{, 41} Ans, états-unis ( ^{, 42}. BAP1 assemble des complexes protéiques multi-subunit contenant des régulateurs de transcription notamment ASXL1, ASXL2 et ASXL3 (ASXLs), trois orthologues de l’ASX^38,43. ASXLs utilisent le domaine DEUBiquitinase ADaptor (DEUBAD), également appelé domaine ASXM, pour stimuler l’activité BAP1 DUB^35,36,44. Par conséquent, ASXLs jouent des rôles importants en coordonnant l’activité DEB DEB de BAP1 à la chromatine et plus largement sa fonction de suppresseur de tumeur.

Plusieurs méthodes existent pour étudier les processus d’ubiquitination et de déubiquitination. Notamment, les essais biochimiques utilisant des protéines purifiées des bactéries restent très puissants en démontrant l’ubiquitination directe de, ou l’élimination de l’ubiquiitin de, substrats spécifiques. Ces expériences peuvent être menées pour étudier une gamme de paramètres tels que la détermination de l’exigence de complexes minimaux, la détermination des réactions cinétiques, la définition des relations structure/fonction, et la compréhension de l’impact des pathologies mutations génétiques. Ici, nous fournissons des protocoles pour mener des réactions d’ubiquitination et de deubiquitination sur des substrats de chromatine avec des composants purifiés. En tant que système modèle, l’ubiquitination in vitro et la deubiquitination de la protéine nucléosomale H2A sont présentées. Les protéines purifiées par les bactéries assemblées dans des complexes minimaux de RING1B/BMI1 et BAP1/DEUBAD sont utilisées respectivement pour l’ubiquitination ou la déubiquitination du H2A nucléosomal.