蛍光活性化細胞選別によるヒトの皮膚からの乳頭状および網状線維芽細胞の単離

ヒトの皮膚は、26 ~ 61 歳の白人の男性と女性 (日焼けした皮膚、腹部の矯正、乳房の減少) から得られた。書かれた患者の同意書は、ヘルシンキ宣言に従って組織のコレクションの前に取得しました, ウィーン医科大学機関レビュー委員会の承認を得て. 注:私たちは、完全な厚さの真皮から (セクション1を参照してください)、またはその異なる層にヒト皮膚真皮を区分した後、機能的に明瞭な線維芽細胞亜集団の単離のためのプロトコルを提供します (セクション1をスキップし、直接セクション2を参照). 1. 真皮厚の完全な厚さの調製 厚い濾紙上で表皮が下向きになるように 10 cm x 10 cm の人間の皮の部分 (例えば、腹部の訂正または乳房の減少から) を置きなさい。 表皮を鉗子でしっかりと持ち、皮下脂肪層をメスで削り取る。その後、ペトリ皿に入れる前に、組織を5mm 幅の細片にスライスする。注:これは、ディスパーゼ II の浸透を容易にします (以後、解離酵素と呼ばれ、セクション3を参照)、表皮が真皮全体から分離される必要がある場合に使用される。このスキップセクション2については、セクション3を直接参照してください。汚染を避けるために、外科的切除後に組織を無菌状態に保つか、エタノールまたはヨウ素溶液で徹底的に洗浄してください。場合によっては、皮膚表面のエタノール処理は、軽度の細胞死のみを引き起こす。ティッシュの文化の流動フードの生殖不能の条件の下で働きなさい。 2. ヒト皮膚真皮を Dermatome で乳頭と網状層に区分する 厚い濾紙に 10 cm x 10 cm の皮の部分 (例えば、腹部の訂正または乳房の減少から) を置きなさい、表皮は上向きに向いている。鉗子でその縁にしっかりと肌を保持します。 Dermatome の頭部を自分から遠ざけることにより、皮膚の表面に対する90°の角度でブレードを使用して、電気 dermatome で皮膚をスライスし、切断厚さ/深さを300μ m に調節します。 表皮と真皮の乳頭からなる第一層 (300 μ m 厚の「真皮層1」、図 1および図 2) を取り、ペトリ皿に入れる。セクション3にすぐに進むか、または 1x PBS を追加して、組織を乾燥から守ります。注:汚染を避けるために、外科的除去後に組織を無菌に保つか、エタノールまたはヨウ素溶液で徹底的に洗浄してください。ティッシュの文化の流動フードの生殖不能の条件の下で働きなさい。注意:刃が非常に鋭いので dermatome を注意深く扱いなさい。 ステップ2.2 に dermatome を調整し、切断厚さを700μ m にし、残りの真皮をスライスします。上部細層 (「真皮層2」、図 2) として定義されている上部スライスを別のペトリ皿に配置する。セクション4にすぐに進むか、または 1x PBS を追加して、組織を乾燥から守ります。 皮下脂肪層を低網状真皮層の残留下 (> 1000 μ m) からメスで削り、それを捨てる。より低い真皮網 (「真皮層3」、図 2) を別のペトリ皿に集める。セクション4にすぐに進むか、または 1x PBS を追加して、組織を乾燥から守ります。注:あるいは、メスで脂肪を掻き取るのではなく、はさみで脂肪層を取り除きます。これは、脂肪を掻き取る前に、氷の網状層を氷上に置くのに役立つことがある。 3. 表皮と真皮の分離 3 U/mL の解離酵素 (すなわち、ディスパーゼ II) 溶液を無菌 1x PBS に調製する。5 mm の皮膚縞を (セクション1から)、または表皮/乳頭状の真皮 (ステップ2.2 から) に置き、10 mL の 3 U/mL の解離酵素溶液で10cm のペトリ皿において表皮を上方に向けた。37° c のペトリ皿を1時間インキュベートします。 プロトコルはここで一時停止されるかもしれません。代わりに4° c で冷蔵庫のプロテアーゼで表皮/乳頭真皮をインキュベートします。必要に応じて他の層 (真皮層1、2および 3) を保存し、4° c で 50 mL チューブ中の 1x PBS に浸した。注意:プロテアーゼを注意深く働かせると、接触すると皮膚や目に刺激を及ぼします。 インキュベート後、表皮/乳頭真皮をペトリ皿の乾燥した蓋に移し、表皮または真皮のどちらかの端を保持している2つの鉗子を持つ真皮 (真皮層 1) と皮を分離する。 4. 真皮組織の酵素消化 各真皮層 (真皮層1、2および 3) を、できるだけ徹底的にはさみ/メスと別々にミンチする。小片が小さければ小さいほど、組織消化が良くなります。注:真皮の靭性は、それが由来する身体部位 (例えば、腹部または上腕皮膚) に依存して変化し得る。 1.25 mg/mL コラゲナーゼの I, 0.5 mg/ml コラゲナーゼ II, 0.5 mg/ml のコラゲナーゼ IV および 0.1 mg/ml のヒアルロニダーゼダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM)、L-グルタミン (材料の表参照)、10% ウシ胎児血清 (FCS) および 1% ペニシリン/ストレプトマイシン (P/S)。注意:これらは接触時に皮膚や目を刺激する可能性がありますようにコラゲナーゼで慎重に作業. 準備された消化力の10ml をそれぞれのミンチ組織を 50 mL チューブに入れ、恒久的な攪拌の下で37° c の温水浴で1時間インキュベートします。消化中にチューブを数回反転します。注:1つは、ミンチ皮膚片のサイズに応じて消化量を調整することを検討する必要があります.あまりにも多くの組織と 10 mL の消化ミックスをオーバーロードしないでください細胞の収量は最小限になります。全体積内の組織の3分の1未満が推奨されます (1:2 w/v)。 5. 単一細胞懸濁液および赤血球溶解の調製 10 mL の線維芽細胞培地 (L-グルタミン、10% FCS および 1% P/S) を消化された組織に添加することによって酵素組織消化を停止する。ここから氷上で作業します。 定期的な滅菌ステンレスティーストレーナーを介して各チューブの内容を注ぎ、きれいなペトリ皿で細胞懸濁液を収集します。注射器を使って、未消化のティッシュピースをシリンジ・プランジャーの端で洗ってください。 その後、ピペットは、70μ m の細胞ストレーナーを通して細胞懸濁液を 50 mL チューブに集めた。培地でこした細胞をすすぎ、同じ管に流れを集める。 4° c で10分間 500 x gにチューブを遠心分離し、5 mL の線維芽細胞で上清と洗浄細胞ペレットを除去および廃棄します。遠心分離ステップを繰り返します。 上清を除去し、1 mL 自己作成 ACK 赤血球溶解バッファー (0.15 M NH4Cl、10 mM KHCO3, 0.1 mM Na2EDTA; pH 7.2 \ u 20127.4) でペレットを再懸濁します。周囲温度 (20 \ u201222 ° c) で約1分間溶解バッファー内の細胞を残します。 10% FCS と 1x PBS の 9 mL を追加することによって溶解を停止し、5分間4° c で 500 x gで再びチューブを遠心分離します。上清を捨てる。注意:赤血球溶解におけるインキュベーション時間は、溶解が不完全であると思われる場合に調整することができる (赤色ペレット)。しかし、細胞の線維芽細胞と免疫セルの溶菌を避けるために、あまりにも長い間赤血球溶解バッファー内にセルを放置しないでください。 6. FACS のための線維芽細胞のブロッキングと染色 ヒト fc ブロッカーの100μ l 中の 10% FCS および再懸濁細胞を用いた 1x PBS の100μ l のヒト Fc レセプターブロッキング溶液5μ l を調製します。氷上で10分間インキュベートします。 ヒトの皮膚線維芽細胞を染色する FACS 染色パネルを設計する。混合抗ヒト FAP APC (1:20)、抗ヒト CD90 AF700 (1:30)、抗ヒト E-カドヘリン PE (1:20)、抗ヒト CD31 FITC (1:30)、抗ヒト CD45 パシフィックブルー (1:20)、抗ヒト ITGA6 PE (1:20)、抗ヒト CD235ab パシフィックブルー (1: 1000) および抗ヒト CD106 パシフィック青 (1:100) で 10% FCS の 1x PBS で。 Fc 受容体ブロッキング後、細胞を 500 x gで4° c で3分間スピンさせる。100μ l の抗体混合で上清および再懸濁細胞を除去して廃棄する。4° c の暗所で20分間細胞をインキュベートします。 染色する前に、未染色および単染色の FACS コントロールのための高い細胞数でサンプルの20μ l を取り除いてください。 染色された細胞と FACS コントロールを、500μ l 1x PBS を 10% FCS で2回洗浄し、4° c で3分間 500 x gで遠心分離します。その間、4′, 6-diamidino-2-フェニル (DAPI) を 10% FCS の 1x PBS に添加して、1μ g/mL の最終濃度を作ります。 上澄み液を除去して、200μ l の再懸濁細胞を DAPI 溶液中で濾過し、70μ m 細胞ストレーナーを通して各細胞懸濁物を5ml の FACS チューブに通す。注:FACS が遅れて実行される場合、DAPI を追加し、記録の直前にフィルターをかけます。 7. ヒトの皮膚線維芽細胞サブセット分離と FACS のためのゲーティング戦略 フローサイトメトリーコントロールを記録し、正しい電圧設定を設定し、適切な補正を実行します。単一細胞および生きている (DAPI-)、太平洋青、PE および FITC 陰性細胞 (CD45、CD31-、CD235ab-、CD106-、ITGA6-および E-カドヘリン)のためのゲート: 3 つの線維芽線集団を得ること。CD90-、fap+CD90 + および fap-CD90+細胞。図 3を参照してください。 3つの線維芽細胞亜集団を別々の 1.5 mL スクリューキャップにマイクロ遠心、RNA 単離のための350μ l 溶解バッファーで充填するか、350μ l 線維芽細胞増殖培地 (材料の表を参照) で満たしました。ソートの直後にチューブを反転させ、そのいずれかを液体窒素に溶解緩衝管を入れて、スナップを凍結するか、または中管を氷上に置く。注意:0.1% b-メルカプトエタノールで溶解緩衝液をヒュームフードに調製し、吸入を避けます。 8線維芽細胞と脂肪生成アッセイの培養 FACS に続いて、500 x gで4° c で3分間スピンした細胞を、線維芽細胞増殖培地 (5000 \ u201210, 000 細胞/ウェル) で 48-ウェル細胞培養皿において等量にする。彼らは 70% コンフルエントに達するまで成長する細胞を残します。 5μ g/mL のインスリンを加え、5μ m トログリタゾン、0.5 mM 3-メチルイソブチルキサンチン-1-メチルキサンチン (IBMX) および1μ m dexametasone を線維芽細胞増殖培地に添加して脂肪細胞分化培地を調製した。 培養細胞の培地を脂肪細胞に置換し、細胞を14日間分化させます。2日目以降の交換培地は、5μ g/mL インスリンおよび5μ m トログリタゾンを含有する脂肪生成培地を減少させた。3rdまたは4日目ごとに培地を補充する。 分化日14で周囲温度 (20 \ u201222 ° c) で20分間 4% PFA で細胞を固定します。ウェルを 60% の isopropanol で洗浄し、完全に蒸発させます。5 mM オイルレッド O (使用前にフィルター) を用いて細胞を染色し、20分間、染色した細胞を蒸留水で4回洗浄する。顕微鏡検査の実行に進みます。注意:PFA は有毒で有害です。丁寧に取り扱ってください。注:プロトコルはここで一時停止することができます。固定された細胞は、オイルレッド O 染色が行われるまで4° c で 1x PBS に保存することができます。蒸発を避けるために、貯蔵前にパラフィンフィルムとカバーディッシュ。 透過光で10倍の倍率で倒立顕微鏡で水中に浸漬した画像セル。