Dit manuscript beschrijft een FACS-gebaseerd protocol voor isolatie van papillaire en reticulaire fibroblasten van menselijke huid. Het omzeilt in vitro cultuur die onvermijdelijk was met de algemeen gebruikte isolatie protocol via explant culturen. De afkomstige fibroblast subsets zijn functioneel onderscheiden en display differentieel genexpressie en lokalisatie binnen de dermis.
Fibroblasten zijn een zeer heterogene cel populatie betrokken bij de pathogenese van veel menselijke ziekten. In de menselijke huid dermis, fibroblasten zijn van oudsher toegeschreven aan de oppervlakkige papillaire of lager reticulaire dermis volgens hun histologische lokalisatie. In de muis dermis, papillaire en reticulaire fibroblasten afkomstig uit twee verschillende geslachten met uiteenlopende functies met betrekking tot fysiologische en pathologische processen en een aparte cel oppervlakte marker expressie profiel waarmee ze kunnen worden onderscheiden.
Belangrijk is dat het bewijs van explant culturen uit oppervlakkige en lagere dermale lagen suggereren dat ten minste twee functioneel onderscheiden dermale fibroblasten lineages bestaan in de menselijke huid dermis ook. Echter, in tegenstelling tot voor de muis huid, cel oppervlak markers waardoor de discriminatie van verschillende fibroblast subsets nog niet zijn vastgesteld voor de menselijke huid. We ontwikkelden een nieuw protocol voor de isolatie van menselijke papillaire en reticulaire fibroblast populaties via fluorescentie-Activated Cell Sorting (FACS) met behulp van de twee cel oppervlakte markers fibroblast activatie proteïne (FAP) en Thymocyte antigen 1 (Thy1)/CD90. Deze methode maakt het isoleren van zuivere fibroblast subsets mogelijk zonder in vitro manipulatie, die werd aangetoond dat de genexpressie beïnvloeden, waardoor nauwkeurige functionele analyse van de menselijke dermale fibroblast subsets met betrekking tot weefsel homeostase of ziekte Pathologie.
Als belangrijkste cellulaire component van bindweefsel, zijn fibroblasten hoofdzakelijk verantwoordelijk voor de afzetting van collageen en elastische vezels die uiteindelijk de extracellulaire matrijs1vormen, en zo, hun rol in weefsel homeostase, regeneratie en ziekte is onderschat voor een lange tijd. Echter, fibroblasten zijn onlangs onder de schijnwerpers van onderzoekers, niet alleen omdat ze vertegenwoordigen een prominente cellulaire bron voor geïnduceerde pluripotente stamcellen2 , maar ook vanwege hun hoge plasticiteit en implicatie in de pathogenese van een groot aantal ziekten zoals orgaan fibrose3,4,5 of kanker6,7.
Menselijke huid is samengesteld uit een multi-layered epitheel, de epidermis, en de onderliggende bindweefsel, de dermis, die kan worden histologisch onderverdeeld in de bovenste papillaire en de onderste reticulaire dermis en is voornamelijk samengesteld uit fibroblasten en extracellulaire matrijs8 en dermis. Volgens hun plaats binnen het weefsel, zijn de dermale fibroblasten ruwweg geclassificeerd in papillaire en reticulaire fibroblasten1.
Belangrijk, recente gegevens blijkt dat deze dermale fibroblast sub-populaties zijn niet alleen histologisch te onderscheiden, maar ook dat hun functie is aanzienlijk divers. In de huid van de muis, papillaire en reticulaire fibroblasten ontstaan uit twee verschillende geslachten tijdens embryogenese9. Verschillende lijnen van het bewijs suggereert dat de twee geslachten verschillende rollen uitoefenen, niet alleen in weefsel homeostase, haarfollikel morfogenese, wond reparatie en fibrose7,9,10, maar ze ook reageren op verschillende signalen van neoplastische epidermale stamcellen11, wat suggereert uiteenlopende rollen in de pathogenese van kanker. Gunstig, beide lineages Express een duidelijke set van wederzijds exclusieve cellulaire markers in volwassen muis huid, waardoor de isolatie van zuivere dermale fibroblast populaties en de daaropvolgende uitgebreide analyse van hun specifieke functies in vitro9 , 11.
Dienovereenkomstig, ten minste twee verschillende fibroblast subsets met verschillende morfologie en functies, met inbegrip van uiteenlopende proliferatie percentages, weefsel remodeling capaciteiten12,13, evenals de mogelijkheid om de groei van de ondersteuning van epidermale stamcellen in vitro, zijn beschreven voor de menselijke huid dermis14,15. Echter, de meeste van de gepubliceerde studies over menselijke dermale fibroblasten zijn uitgevoerd met behulp van gemengde fibroblast populaties geïsoleerd van explant culturen uit dermatomed huid, omdat specifieke cel oppervlakte marker sets waardoor de isolatie van zuivere menselijke papillaire of reticulaire fibroblast sub-bevolkingen in analogie met de muis dermis moesten nog worden vastgesteld.
We hebben onlangs aangetoond, dat de menselijke huid papillaire en reticulaire fibroblasten worden gekenmerkt door specifieke cel oppervlakte markers die de isolatie van de respectieve sub-populaties mogelijk te maken via fluorescentie-geactiveerde cel sorteren (FACS)16: FAP + CD90– fibroblasten vertegenwoordigen papillaire fibroblasten voornamelijk gelegen in de bovenste dermis, presenteren hogere proliferatie percentages, een duidelijke gen handtekening, maar geen adipogenic potentieel. FAP+CD90+ en FAP–CD90+ fibroblasten behoren tot de reticulaire afstamming van de lagere dermale compartimenten, die minder proliferatie, maar gemakkelijk ondergaan adipogenesis-een kenmerk voor reticulaire fibroblasten. Deze methode maakt het mogelijk om deze verschillende fibroblast subpopulaties uitvoerig te bestuderen, niet alleen in verband met hun specifieke functies onder fysiologische omstandigheden, maar ook in de context van de pathogenese van cutane ziekten, waaronder huidkanker.
Echter, aangezien fibroblasten veranderen hun cel oppervlakte marker expressie in twee-dimensionale in vitro cultuur16,17,19, de toepassing van ons protocol is beperkt tot de isolatie van primaire fibroblasten van de menselijke dermis en staat niet de identificatie van papillaire of reticulaire fibroblasten in de gemengde bevolking van de cultuur van de cel toe. Belangrijk, hoewel de uitdrukking van cel oppervlakte markers veranderingen in vitro, hebben we aangetoond dat de Fibroblast subsets geïsoleerd volgens het protocol hieronder beschreven behouden hun specifieke functionaliteit bij gekweekte16, waardoor in vitro studies van subset-specifieke eigenschappen onder fysiologische of pathologische omstandigheden.
Tot slot hebben we een protocol ontwikkeld voor het isoleren van verschillende fibroblast subsets via FACS die voor het eerst het isoleren van zuivere fibroblast populaties van de menselijke huid dermis in een naïeve staat toelaat.
In dit artikel beschrijven we een methode voor het isoleren van papillaire en reticulaire fibroblasten van de menselijke huid. CD90 is op grote schaal gebruikt voor de identificatie of isolatie van dermale fibroblasten18,20,21. We hebben echter aangetoond dat naast CD90 + fibroblasten, de menselijke dermis ook havens een CD90– fibroblast bevolking uitdrukken FAP16, die is opgericht als een marker voor geactiveerde fibroblasten en kanker-geassocieerde fibroblasten ( CAFs)22,23,24,25. Belangrijker, we waren in staat om drie fibroblast subpopulaties FAP+CD90–,FAP +CD90+ en FAP–CD90+ in de huid Biopten van alle gezonde menselijke donoren te identificeren. We concluderen daarom dat FAP is niet alleen een marker voor geactiveerde fibroblasten of CAFs maar ook normaal weefsel fibroblasten.
Van de nota, de FAP–CD90– Cell bevolking die na toepassing van de hierboven beschreven uitsluiting-en gating strategie bevat geen fibroblasten, omdat deze cellen niet vermenigvuldigen in fibroblast teeltmedium in vitro, maar de meeste waarschijnlijk een gemengde cel populatie met inbegrip van lymfe cellen en pericyten onder andere16.
De cel opbrengst die door gebruik van bovengenoemd protocol wordt verkregen kan variëren afhankelijk van het lichaamsdeel dat het huid stuk dat voor de isolatie wordt gebruikt voortkomt uit. Dermis van verschillende lichaamsdelen verschilt betreffende zijn structuur, dikte evenals collageen samenstelling. Bijvoorbeeld, de huid van het gezicht of de bovenarm is veel dunner dan de huid van de buik of de dij, die ook vaak weer een dikkere onderhuidse vet laag. Bovendien, leeftijd en geslacht van de huid donoren kan verder niet alleen invloed op de weefsel dissociatie efficiëntie, maar kan ook invloed hebben op de verdeling van de drie fibroblast subpopulaties (Figuur 3) wanneer geïsoleerd van de volledige dikte huid. Dit vloeit voort uit het feit dat papillaire dermis krimpt en dat de totale aantallen van de Fibroblast daling met leeftijd11,26,27,28. Bovendien zal de cel pellet van papillaire dermis waarschijnlijk groter zijn dan van reticulaire dermis, aangezien de bovenste dermis is meer dicht bevolkt door fibroblasten dan de reticulaire dermis. Bovendien, lagere dermis is ook taaier en meer dicht ingepakt met collageen, die het moeilijker maakt om het weefsel te scheiden en de fibroblasten vrij te geven. Van de nota, kan de cel pellet lijken erg rood, dat is de reden waarom rode bloedcel lysis wordt aanbevolen.
Naast de identificatie van drie sub-bevolkingen in intacte menselijke huid, tonen wij ook aan dat in dermatomed huid, elke fibroblast ondergroep of in papillaire of reticulaire dermis16wordt verrijkt. Het nauwkeurige snijden van de huid met dermatoom is essentieel om een juiste verrijking van elke subpopulatie van verschillende huidlagen te verkrijgen. Aangezien de papillaire dermis is zeer dun, de dermatomed Slice die het mag niet hoger zijn dan een dikte van 300 µm. bovenste reticulaire en lagere reticulaire fibroblasten beide vertegenwoordigen de reticulaire lijn en weer te geven soortgelijke functies en gen handtekeningen, Daarom zou men ook kunnen overwegen niet te scheiden.
Belangrijker, alle drie de fibroblasten populaties zijn te vinden in de dermis en zijn niet uitsluitend aanwezig in een laag, dat is de reden waarom explant culturen uit papillaire of reticulaire dermis resulteren in gemengde fibroblast culturen. Echter, FAP+CD90– papillaire fibroblast zijn het meest overvloedig in de papillaire dermis en volg een gradiënt van oppervlakkig naar lagere dermale lagen, terwijl FAP+CD90+ en FAP–CD90+ fibroblasten volgen een omgekeerde gradiënt van lager aan oppervlakkige lagen16. Bovendien is de meerderheid van de CD90+ fibroblasten van de papillaire dermis bijna uitsluitend gevonden rond de bloedvaten en Express de perivasculaire FIBROBLAST marker CD14629, en dus waarschijnlijk vertonen verschillende functies dan de het blijven CD146– reticulaire fibroblasten16. CD146 kan worden gebruikt als een extra marker in de gating strategie om deze populatie uit te sluiten.
Na de dissociatie van dermale lagen, zijn de geïsoleerde cellen gekleurd met een speciaal ontworpen antilichaam cocktail met verschillende antilichamen voor de uitsluiting van immuun cellen, endothelial en lymfe cellen, epidermale cellen, bezinkingen en MSCs om verkrijgen van pure fibroblast populaties. Van de nota, het kiezen van een marker voor de identificatie en uitsluiting van MSCs kan lastig zijn vanwege het hoge aantal gepubliceerde MSC markers30,31. Sinds MSCs Express CD90 zoals fibroblasten, kunnen extra MSC markers zoals CD105 of CD271 nuttig blijken voor hun identificatie. Echter, MSCs vertegenwoordigen slechts een zeer laag percentage van alle dermale cellen en sinds CD90+ fibroblasten display typische morfologische kenmerken van fibroblasten bij het sorteren, zou men kunnen stellen dat de uitsluiting van MSCs door het gebruik van verschillende oppervlakte markers cel zou kunnen onnodig zijn.
Belangrijk, analyseerden wij FAP en CD90 gen uitdrukking na het houden van de cellen in cultuur voor 7-14 dagen na het sorteren (gegevens niet getoond) en vonden dat de uitdrukking van beide tellers in respectieve gesorteerde enige positief (FAP+CD90– of FAP–CD90+) cellen16. Wij benadrukken daarom dat de hierboven beschreven marker sets en het protocol het mogelijk maken de isolatie van primaire fibroblast subsets rechtstreeks uit het weefsel, maar niet van eerder gekweekte gemengde fibroblast populaties.
Niettemin, tonen wij aan dat de functionaliteit van alle drie sub-bevolkingen in de cultuur van de cel ongeacht de wijziging van de markerings uitdrukking van de cel oppervlakte wordt behouden, aangezien fibroblasten gesorteerd als FAP+CD90– papillaire fibroblasten niet verwerven van de mogelijkheid om adipogenesis ondergaan na een langere periode van cultuur, terwijl fibroblasten gesorteerd als FAP+CD90+ of FAP–CD90+ reticulaire fibroblasten handhaven hun vermogen om te differentiëren in adipocyten 16 . Belangrijk is, vonden we ook dat papillaire en reticulaire-specifieke genen nog steeds worden uitgedrukt in een hogere mate in FAP+CD90– en CD90+ respectievelijk.
Samenvattend, hebben wij een protocol voor de isolatie van functioneel DISTINCT fibroblast ondergroepen via FACS gevestigd die voor het eerst de isolatie en de analyse van zuivere en naïeve fibroblast subpopulaties van menselijke huid dermis toelaat. Deze methode vestigt een belangrijke vordering aan het algemeen gebruikte fibroblast explant de isolatie Protocol van de cultuur van hogere en lagere dermis zoals (i) een verzettende gradiënt van papillaire en reticulaire fibroblasten bestaat van de huidoppervlakte aan dermis en (II) fibroblasten veranderen hun gen handtekening in vitro.
The authors have nothing to disclose.
Wij erkennen dankbaar hulp bij FACS-sortering door Bärbel Reininger en Wolfgang Bauer. Dit werk werd gesteund door toelagen aan B. M. L. van het Oostenrijkse wetenschaps Fonds (FWF: V 525-B28), en de Federatie van Europese biochemische maatschappijen (FEBS, het onderzoek Fonds van de follow-up). S. F. is de ontvanger van een DOC Fellowship van de Oostenrijkse Academie van Wetenschappen (OeAW). Wij zijn dankbaar voor de uitstekende ondersteuning van de kernfaciliteiten van de medische universiteit van Wenen. Wij danken Bernhard Gesslbauer, Christine Rijckaert en Martin Vierhapper voor het verstrekken van menselijk huidmateriaal.
Material: | |||
3-isobutyl-1-methylxanthine | Sigma | I5879 | |
Ammonium chloride | Sigma | 9718 | used for selfmade ACK Lysis Buffer |
Amniomax-C100 (1x) Basal Medium | Gibco | 17001-074 | used for fibroblast growth medium |
β-Mercaptoethanol | Scharlau | ME0095 | ! CAUTION |
C100 Supplement | Thermo Scientific | 12556015 | used for fibroblast growth medium |
Collagenase I | Thermo Scientific | 17100017 | ! CAUTION |
Collagenase II | Gibco | 17101015 | ! CAUTION |
Collagenase IV | Sigma | C5138 | ! CAUTION |
DAPI | Thermo Scientific | 62248 | |
Dexamethasone | Sigma | D8893 | |
Dispase II | Roche | 4942078001 | ! CAUTION |
Dulbecco‘s Modified Eagle Medium + GlutaMAX | Gibco | 31966-021 | |
EDTA disodium salt | Sigma | E1644 | used for selfmade ACK Lysis Buffer |
Fetal bovine serum (heat inactivated) | Gibco | 10500-064 | |
Hyaluronidase | Sigma | H4272 | ! CAUTION |
Insulin | Sigma | I5500 | |
Isopropanol | Merck | 1,096,341,011 | |
OilRed O | Sigma | O-0625 | |
Paraformaldehyd | Sigma | 158127 | ! CAUTION Cancerogenic. Skin and eye irritant. Handle with care. |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15070-063 | |
Phosphate-buffered saline without Ca++ & Mg++ | Lonza | BE17-512F | |
Potassium bicarbonate | Sigma | 237205 | used for selfmade ACK Lysis Buffer |
PureLink RNA MicroKit | Invitrogen | 12183-016 | |
SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR | Invitrogen | 11752 | |
Taqman 2xUniversal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4324018 | ! CAUTION Skin and eye irritant. |
Troglitazone | Sigma | T2573 | |
Name | Company | Catalog Number | Yorumlar |
Flow cytometry Antibodies: | |||
anti human CD31-AF488 | Biolegend | 303109 | Dilution: 1:30, Lot: B213986, RRID: AB_493075 |
anti human CD45-Pacific blue | Biolegend | 304029 | Dilution: 1:20, Lot: B218608, RRID: AB_2174123 |
anit human CD49f/ITGA6-PE | Serotec | MCA699PE | Dilution: 1:20, Lot: 0109, RRID: AB_566833 |
anti human CD90/Thy-1-AF700 | Biolegend | 328120 | Dilution: 1:30, Lot: B217250, RRID: AB_2203302 |
anti human CD106-AF421 | BD | 744309 | Dilution: 1:100, Lot: 7170537, RRID: x |
anti human CD235ab-Pacific blue | Biolegend | 306611 | Dilution: 1:1000, Lot: B224563, RRID: AB_2248153 |
anti-human E-cadherin-PE | Biolegend | 147304 | Dilution: 1:20, Lot: B197481, RRID: AB_2563040 |
anti human FAP-APC | R&D | FAB3715A | Dilution: 1:20, Lot: AEHI0117111, RRID: x |
Human TruStain FcX | Biolegend | 422302 | Dilution: 1:20, Lot: B235080, RRID: x |
Name | Company | Catalog Number | Yorumlar |
Equipment: | |||
1.4 mL micronic tubes | Thermo Scientific | 4140 | |
1.5 mL screw cap micro tube | Sarstedt | 72,692,405 | |
5 mL Polystyrene Round Bottom Tube with cell strainer cap | Falcon | 352235 | |
48-well cell culture cluster | Costar | 3548 | |
50 mL polypropylene canonical tubes | Falcon | 352070 | |
70 µm cell strainer nylon | Falcon | 352350 | |
Aesculap Acculan 3Ti Dermatome | VWR | AESCGA670 | |
Aesculap Dermatome blades | VWR | AESCGB228R | |
MicroAmp Fast Optical 96well | Applied Biosystems | 4346906 | |
Primary cell culture dish | Corning | 353803 | |
Scalpel blades | F.S.T | 10022-00 | |
Tea strainer | x | x | |
Name | Company | Catalog Number | Yorumlar |
Fibroblast growth medium: | |||
AmnioMAX basal medium with AmnioMAX C-100 Supplement, 10 % FCS and 1 % P/S |