Özet

Электрофорез ДНК, вместо тиазол оранжевый бромид Ethidium или альтернативных красители

Published: March 31, 2019
doi:

Özet

Здесь мы представляем протокол тиазол оранжевый для обнаружения ДНК в экспериментах электрофореза геля. Использование тиазол оранжевый позволяет ликвидации бромид ethidium, и флуоресценции обнаружения может быть достигнуто с УФ или синий свет.

Abstract

Электрофорез геля дна агарозы с помощью является общим инструментом в лаборатории молекулярной биологии, позволяя разделения фрагментов ДНК по размеру. После разделения ДНК является визуализированы пятнать. Эта статья демонстрирует использование тиазол оранжевые пятна ДНК. Тиазол оранжевый выгодно общих пятная методов, в том, что чувствительные, недорогой, возбудимых с УФ или синий свет (во избежание повреждения образца) и безопаснее, чем бромид ethidium. Лаборатории, уже оснащены для запуска ДНК электрофорез эксперименты с использованием бромид ethidium обычно можно переключиться существующих протоколов, с помощью ультрафиолетовый свет для обнаружения красителей без дополнительных изменений. Синий свет обнаружения повреждения образца дополнительно может быть достигнуто с фильтром источника и выбросов синий свет. Лаборатории, уже оборудованные для обнаружения синий свет можно просто переключиться красителей без дополнительных изменений к существующим протоколам.

Introduction

Этот метод предназначен для выявления ДНК в гелях агарозы, используя тиазол оранжевый (для) для флуоресценции обнаружения. Из-за его низкой стоимости и благоприятные безопасности профиля тиазола оранжевый может увидеть особую пользу в Бакалавриат учебных лабораторий и исследовательских лабораторий, выполняющих молекулярной биологии, особенно перешнуровок и клонирования.

Бромид ethidium остается наиболее распространенных краситель для обнаружения ДНК в гелях агарозы. Это главным образом потому, что она может быть получена весьма недорого и только требует возбуждения с ультрафиолетовый свет для обнаружения. Обе ethidium бромид и тиазол оранжевый недорогой, с низкой обнаружения пределов (1-2 нг/пер)1. Есть два главных недостатка бромид ethidium, однако, которые тиазол оранжевый улучшает.

Во-первых, бромид ethidium является мутагенным2 с специальной обработки, доставки и удаления требования, тогда как тиазол оранжевый менее мутагенные (3 – 4 x менее мутагенному Эймс теста)3,4 и может быть вообще утилизировать вместе с общие химические отходы.

Во-вторых бромид ethidium требует ультрафиолетовый свет для обнаружения. Тиазол оранжевый при желании также можно использовать УФ-излучения, но также могут быть обнаружены с синим светом. Ультрафиолетовый свет, в то время как широко используется, имеет несколько характерных недостатков. Во-первых это ущерб человеческой кожи и глаз. В то время как ультрафиолета может безопасно использоваться обученными профессионалами, кожи или глаз случайных (функционально похож на солнечных ожогов) от Лаборатория УФ света не являются редкостью особенно с неопытными учеными. Во-вторых ультрафиолета чрезвычайно повреждения ДНК образцов5, что снижает успех течению экспериментов (например, перевязки и трансформации)1,6,7. В позволяет обнаруживать с голубой свет (λex, Макс = 510 Нм (488 нм и 470 Нм также показывают сильного возбуждения)), которая не вызывает повреждения кожи или ДНК повреждения (хотя любой интенсивный свет все еще могут быть вредны для глаз), значительно снижается риск как ученый и образец.

Является не только Люминесцентную краску альтернативой бромид ethidium; его преимуществом является стоимость. ЧТОБЫ был обнаружен в 1980-х как пятно ретикулоцитов8и утилита в ряде на основе ДНК флуоресценции эксперименты9,10,11,12,13. В настоящее время он продается с несколькими поставщиками. Это родительский комплекса дополнительных, более дорогие, синий свет – необнаруживаемых коммерческих красители и ведет себя аналогично во время электрофореза, используя УФ или синий свет для обнаружения1. Кроме того в то время как другие красители более чувствительны к очень низкой концентрации ДНК чем бромистый этидий или к, для универсального электрофорез эксперименты, такие красители являются дорогими во многих контекстах.

Protocol

1. Подготовка геля Примечание: Для общего гель Протоколы электрофореза, смотрите также П.Ю. ли, и др. 14. Смешайте агарозы (~ 1% w/v, процент может варьироваться для определенного размера Цветоделение) в буфере (примерно 70 мл для мини-гель (8 x 7 см)). Буферы, о?…

Representative Results

Тиазол оранжевый позволяет обнаружение ДНК, без использования бромид ethidium и без использования ДНК повреждения УФ-излучения. Бромид ethidium известный быть мутагенными свойствами, поэтому его ликвидации из лаборатории может быть выгодным. Свет УФ повреждений ДНК и снижает эффективность п?…

Discussion

Бромид ethidium уже давно стандартным инструментом в лаборатории молекулярной биологии, несмотря на известные токсичности. Он также страдает от требующих УФ света, который повреждает ДНК, как он определяется. Тиазол orange предлагает недорогой альтернативой бромид ethidium, а также полезные, но ?…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана запуска средства для пог от Университет Кристофера Ньюпорта.

Materials

2-log DNA ladder New England Biolabs N0469S
Agarose (Genetic Analysis Grade) Fisher BP1356-100
Blue-light flashlight WAYLLSHINE (Amazon) WAYLLSHINE Scalable Blue LED
ChemiDoc MP Biorad 1708280
DMSO Sigma-Aldrich D8418
ethidium bromide Fisher BP1302-10 For comparison, not necessary for protocol
Gel apparatus (Owl Easy Cast) Thermo Scientific B1A
Qiagen Qiaquick Gel extraction kit Qiagen 28704
Safe Imager Viewing Glasses Invitrogen S37103 Necessary for using blue light flashlight.*
SafeImager 2.0 (Blue light transilluminator) Invitrogen G6600 Blue light flashlight may be used as alternative
SYBR Safe Invitrogen S33102 For comparison, not necessary for protocol
TAE (Tris-Acetate-EDTA) Corning 46-010-CM
Thiazole orange Sigma-Aldrich 390062
*Glasses are also included with Invitrogen G6600

Referanslar

  1. O’Neil, C. S., Beach, J. L., Gruber, T. D. Thiazole orange as an everyday replacement for ethidium bromide and costly DNA dyes for electrophoresis. Electrophoresis. 39 (12), 1474-1477 (2018).
  2. McCann, J., Choi, E., Yamasaki, E., Ames, B. N. Detection of carcinogens as mutagens in the Salmonella/microsome test: assay of 300 chemicals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (12), 5135-5139 (1975).
  3. Evenson, W. E., Boden, L. M., Muzikar, K. A., O’Leary, D. J. 1H and 13C NMR Assignments for the Cyanine Dyes SYBR Safe and Thiazole Orange. The Journal of Organic Chemistry. 77 (23), 10967-10971 (2012).
  4. Beaudet, M., Cox, G., Yue, S. . Molecular Probes, Inc. , (2005).
  5. Pfeifer, G. P., You, Y. H., Besaratinia, A. Mutations induced by ultraviolet light. Mutation Research. 571 (1-2), 19-31 (2005).
  6. Cariello, N. F., Keohavong, P., Sanderson, B. J., Thilly, W. G. DNA damage produced by ethidium bromide staining and exposure to ultraviolet light. Nucleic Acids Research. 16 (9), 4157 (1988).
  7. Hartman, P. S. Transillumination can profoundly reduce transformation frequencies. BioTechniques. 11 (6), 747-748 (1991).
  8. Lee, L. G., Chen, C. H., Chiu, L. A. Thiazole orange: a new dye for reticulocyte analysis. Cytometry. 7 (6), 508-517 (1986).
  9. Nygren, J., Svanvik, N., Kubista, M. The Interactions Between the Fluorescent Dye Thiazole Orange and DNA. Biopolymers. , 1-13 (1998).
  10. Svanvik, N., Westman, G., Wang, D., Kubista, M. Light-Up Probes: Thiazole Orange-Conjugated Peptide Nucleic Acid for Detection of Target Nucleic Acid in Homogeneous Solution. Analytical Biochemistry. 281 (1), 26-35 (2000).
  11. Yang, P., De Cian, A., Teulade-Fichou, M. P., Mergny, J. L., Monchaud, D. Engineering Bisquinolinium/Thiazole Orange Conjugates for Fluorescent Sensing of G-Quadruplex DNA. Angewandte Chemie International Edition. 48 (12), 2188-2191 (2009).
  12. Fang, G. M., Chamiolo, J., Kankowski, S., Hovelmann, F., Friedrich, D., Lower, A., Meier, J. C., Seitz, O. A bright FIT-PNA hybridization probe for the hybridization state specific analysis of a C → U RNA edit via FRET in a binary system. Chemical Science. 9 (21), 4794-4800 (2018).
  13. Pei, R., Rothman, J., Xie, Y., Stojanovic, M. N. Light-up properties of complexes between thiazole orange-small molecule conjugates and aptamers. Nucleic Acids Research. 37 (8), e59-e59 (2009).
  14. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. Journal of Visualized Experiments. (62), 1-5 (2012).
  15. Vogelstein, B., Gillespie, D. Preparative and analytical purification of DNA from agarose. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (2), 615-619 (1979).

Play Video

Bu Makaleden Alıntı Yapın
O’Neil, C. S., Beach, J. L., Gruber, T. D. DNA Electrophoresis Using Thiazole Orange Instead of Ethidium Bromide or Alternative Dyes. J. Vis. Exp. (145), e59341, doi:10.3791/59341 (2019).

View Video