Una estrategia para identificar compuestos que afectan el crecimiento celular y la supervivencia en células de mamíferos cultivadas a un rendimiento bajo a moderado

Una de las características más importantes que debe determinarse para un compuesto químico que tiene potencial terapéutico es su toxicidad para las células animales. Esta característica determinará si un medicamento es un buen candidato para un estudio más extenso. En la mayoría de los casos, se buscan compuestos con toxicidad mínima, pero hay situaciones en las que un compuesto con capacidad para matar tipos de células específicas es de interés, por ejemplo, fármacos antitumoraligénicos. Aunque los animales enteros son los mejores sistemas modelo para determinar la toxicidad sistémica, el costo y la mano de obra implicadas es prohibitivo cuando es necesario probar más de unos pocos compuestos. Como tal cultivo celular de mamíferos se utiliza generalmente como la alternativa más eficiente^1,2. Las pantallas de fármacos de rendimiento pequeño a mediano son una modalidad importante a través de la cual se puede evaluar la toxicidad en el cultivo celular. Estas pantallas se pueden utilizar para interrogar bibliotecas anotadas dirigidas a vías de señalización individuales. El formato general de una pantalla de este tipo es probar inicialmente todos los compuestos de la biblioteca a una sola dosis (generalmente 10 m) en una pantalla exploratoria de toxicidad primaria, y luego realizar una pantalla de respuesta de dosis secundaria en profundidad para caracterizar completamente la toxicidad perfil de los aciertos de la pantalla principal. Los métodos para implementar esta estrategia se describirán aquí y proporcionarán una manera rápida, eficiente y económica de identificar y caracterizar compuestos tóxicos.

Se han desarrollado múltiples métodos para evaluar la citotoxicidad de compuestos pequeños y nanomateriales en células de mamíferos^3,4. Cabe señalar que ciertos materiales pueden interactuar con el ensayo proporcionando resultados engañosos, y tales interacciones deben probarse al caracterizar los golpes de las pantallas de toxicidad⁴. Los ensayos de citotoxicidad incluyen exclusión azul de trypan⁵, ensayo de liberación de lactato deshidrogenasa (LDH)⁶, ensayo azul de Alamar⁷, éster de acetoximetil calcien (AM)⁸y el ensayo ATP⁹. Todos estos ensayos miden varios aspectos del metabolismo celular que pueden servir como un proxy para el número de celda. Si bien todos ofrecen beneficios, ensayos a base de sal de tetrazolium como 3-(4,5-dimethylthizol-2-yl)-2,5-dphenyltelium bromuro (MTT), 2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfopheny)-2H-tetrazolium-5-carboxyanilide sal interna (XTT)-1, y 4-(3-[4-4- El disulfato de yodofenilo]-2-[4-nitrofenilo]-2H-5-tetrazolio)-1,3-benzeno disulfonato (WST-1)^10,11 proporcionan buena precisión y facilidad de uso a bajo costo. MTT, que se utilizará en esta demostración, se reduce a un formazán insoluble por una reductasa mitocondrial y la tasa de esta conversión se correlaciona fuertemente con el número de celda. Este ensayo se ha utilizado rutinariamente tanto a pequeña escala como para bibliotecas de cribado con hasta 2.000 compuestos^12. El recuento directo de células por un marcador etiquetado ofrece otro método para evaluar el número celular, y a diferencia del ensayo MTT puede proporcionar información adicional sobre la dinámica del crecimiento celular. Varios algoritmos disponibles públicamente están disponibles para realizar análisis automatizados de recuento de celdas y también hay algoritmos propietarios que forman parte de paquetes de software para lectores de imágenes^13,14. En esta descripción del método, una línea de células madre neuronales humanas (NSC) que ha sido editada genéticamente para expresar constitutivamente tdTomato¹⁵ servirá como una línea de prueba para comparar los resultados de viabilidad celular entre un ensayo MTT y un recuento automatizado de células ensayo en una pantalla que evalúe la toxicidad de 57 compuestos de ensayo. Aunque el objetivo principal de esta estrategia era identificar y caracterizar compuestos tóxicos, tiene el beneficio adicional de identificar potencialmente los compuestos inhibidores del crecimiento y mejorar el crecimiento y por lo tanto proporciona un método eficaz para identificar drogas que puede modular el crecimiento celular.