使用稀有的科顿富标记识别氨基酸过度生产者

目前氨基酸的生产严重依赖发酵。然而,大多数氨基酸生产菌株的分度和产量低于全球氨基酸市场日益增长的需求,价值数十亿美元1,2。获得高性能氨基酸过度生产者是氨基酸产业升级的关键。

传统的识别氨基酸过度生产者的策略利用氨基酸和其模拟在蛋白质合成3,4之间的竞争。这些模拟物能够给识别相应氨基酸的tRNA充电,从而抑制肽链的增长,导致被抑制的生长或细胞死亡5。抵抗模拟应力的一种方法是增加细胞内氨基酸的浓度。富集氨基酸将超越有限tRNA的模拟,并确保功能蛋白的正确合成。因此,可以选择在模拟中存活的菌株,并且可能是相应氨基酸的过度生产者。

虽然证明在选择L-亮氨酸6等氨基酸的过度生产者方面是成功的,但基于模拟的策略存在严重缺陷。一个主要问题是来自诱变过程或自发突变的模拟阻力。具有电阻的应变可以通过阻塞、导出或降解^模拟5来逃避选择。另一个担忧是模拟对其他细胞过程的毒性副作用7。因此,在模拟选择中幸存下来的菌株可能不是氨基酸过度生产者,而所需的过度生产者可能由于负面的副作用而被错误地消灭。

本文提出了一种基于科顿偏倚定律的新策略,以便准确、快速地识别氨基酸过度生产者。大多数氨基酸由多个核苷酸三联体编码,由宿主生物^体8、9以不同的方式青睐。有些科顿很少在编码序列中使用,被称为稀有的科顿。它们转化为氨基酸依赖于携带相应氨基酸的干酪tRNA。然而,识别稀有科顿子的tRNA通常比普通科顿10、11的tRNA的丰度低得多。因此,这些稀有的tRNA不太可能在与其他异位接受器的竞赛中捕获游离氨基酸,当氨基酸的量有限^{时,稀有富含克顿序列的翻译开始减速甚至终止10.}理论上,如果由于过度生产或额外喂食相应的^氨基酸12而对同义的通用tRNA收费后,如果存在氨基酸过剩,翻译可以恢复。如果稀有的富含科顿的基因编码了选择或筛选标记,则表现出相应表型的菌株很容易被识别,并且很可能是靶向氨基酸的过度生产者。

应用上述策略建立氨基酸超标生产者的选型和筛选系统。选择系统使用抗生素抗性基因(例如kan R)作为标记,而筛选系统使用编码荧光(例如绿色荧光蛋白 [GFP]) 或色基因(例如 PrancerPurple)蛋白质的基因。通过用同义的稀有替代品替换目标氨基酸的常用通子的定义为号的标记基因,两个系统中的标记基因被修改。在突变库中,含有稀有的富含柯顿标记基因的菌株在适当的条件下被选择或筛选,并且靶向氨基酸的过度产生者很容易被识别。工作流程从构建稀有的富含柯顿标记基因系统开始,然后优化工作条件,然后对氨基酸过度生产者进行鉴定和验证。这种模拟独立策略基于蛋白质翻译中的教条,并已实际验证,能够准确、快速地识别氨基酸过度生产者。从理论上讲,它可以直接用于氨基酸与罕见的科顿和所有微生物。总之,当特定氨基酸无法使用适当的模拟时,或者当高误阳性率是主要问题时,基于稀有的节子策略将作为传统基于模拟的方法的有效替代方法。下面的协议使用亮氨酸稀有科顿来演示这一策略,以识别大肠杆菌L-亮氨酸过度生产者。