כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשיפור תפקוד הלב בעכברים ניוון שרירים דושן transiently על ידי משתילים exosomes נגזר נורמליים ובתאים myogenic.
אצ’יל דושה ניוון שרירים (DMD) היא X-linked רצסיבי גנטי מחלה נגרמת על ידי חוסר חלבון הדיסטרופין פונקציונלי. לא ניתן לרפא את המחלה, כאשר המחלה מתקדמת, החולה מפתחת תסמינים של קרדיומיופתיה מורחבת, הפרעה בקצב הלב, אי ספיקת לב מוגדש. עכברים מוטנטים DMDMDX שאינם מבטאים הדיסטרופין, משמשות כמודל העכבר של DMD. במחקר האחרון שלנו, הבחנו כי הזרקת intramyocardial מסוג רחב (WT)-קדמון myogenic נגזר תאים exosomes (MPC-Exo) transiently לשחזר את הביטוי של הדיסטרופין בשריר של עכברים מוטנטים DMDMDX , אשר היה קשור עם שיפור ארעי בתפקוד הלב רומז WT-MPC-Exo עשוי לספק אפשרות להקל על התופעות לב DMD. מאמר זה מתאר את הטכניקה של MPC-Exo טיהור והשתלות לתוך הלב של עכברים מוטנטים DMDMDX .
ניוון שרירים דושן (DMD) היא X-linked רצסיבי, מתקדמת neuromuscular מחלה הנגרמת על ידי מוטציה בגן DMD ג’ין ואובדן של הדיסטרופין פונקציונלי1. הדיסטרופין מתבטא בעיקר ביכולת שרירי השלד שריר הלב, מתבטאת פחות2,של השריר החלק, בלוטות אנדוקריניות, נוירונים-3. DMD הוא הסוג הנפוץ ביותר של ניוון עם שכיחות של אחד לכל 3,500 ל 5,000 בחורים היילוד ברחבי העולם4,5. אנשים בדרך כלל לפתח שרירים מתקדמת נמק, אובדן של הליכה עצמאית על ידי בגיל ההתבגרות המוקדם, ומוות בעשורים השני כדי השלישי של חייהם עקב אי ספיקת לב, כשל נשימתי6.
קרדיומיופתיה מורחבת, הפרעות קצב, אי ספיקת לב מוגדש הם נפוצים גילויי DMD7,8לב וכלי דם. לא ניתן לרפא את המחלה, טיפול תומך עשוי לשפר את הסימפטומים או לעכב את ההתקדמות של אי ספיקת לב, אבל זה מאוד קשה לשפר את הלב תפקוד9,10.
דומה לחולים DMD, X-linked ניוון שרירים (MDX) עכברים בחוסר חלבון הדיסטרופין ותסמינים הנוכחי של קרדיומיופתיה11, ולכן נמצאים בשימוש נרחב במחקר קרדיומיופתיה DMD הקשורים. כדי לשחזר הדיסטרופין השרירים מושפע, טיפול בתאי גזע allogeneic הוכיחה להיות טיפול יעיל עבור DMD12,13,14. Exosomes, 30-150 nm קרום שלפוחית מופרש על ידי סוגי תאים שונים, לשחק תפקיד מפתח בתקשורת לתא דרך התחבורה גשמי גנטי, כגון RNA שליח (mRNA) ללא קידוד RNAs15,16,17 ,18,19,20,21.
שלנו מחקרים קודמים הראו כי exosomes נגזר ובתאים myogenic (MPC), כגון C2C12 תא קו, באפשרותך להעביר הדיסטרופין mRNA כדי cardiomyocytes המארח לאחר הזרקה ישירה לב22, המציין כי מסירת allogeneic MPC, נגזר exosomes (MPC-Exo) transiently לשחזר DMD ביטוי גנים בעכברים MDX. מאמר זה מתמקד MPC-Exo טכניקות טיהור והשתלות.
השיטה של בידוד exosomes טהור חיוני ללמוד את הפונקציה של exosomes. אחת הטכניקות הנפוצות לבידוד exosome היא glycols פוליאתילן (יתדות) מתווכת משקעים17,18,25. Exosomes יכול להיות זירז, יתדות, מגורען על ידי צנטריפוגה במהירות נמוכה. טיהור בתיווך פג הוא נוח מאוד, בעלות …
The authors have nothing to disclose.
טאנג נתמכו באופן חלקי על ידי איגוד הלב האמריקני: GRNT31430008, NIH-AR070029, NIH-HL086555, NIH-HL134354.
0.22-μm Filter | Fisherbrand | 09-720-004 | |
15-cm Cell Culture Dish | Thermo Fisher Scientific | 157150 | |
24-gauge catheter | TERUMO | SR-OX2419CA | |
31-gauge insulin needle | BD | 328291 | |
4% paraformaldehyde | Affymetrix | AAJ19943K2 | |
50 mL Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339652 | |
6-0 suture | Pro Advantage by NDC | P420697 | |
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | |
Antibiotic Antimycotic Solution | Corning | 30-004-CI | |
Anti-Dystrophin antibody | Abcam | ab15277 | |
Antigen retriever | Aptum Biologics | R2100-US | Antigen recovery |
Autofluorescence Quenching Kit | Vector Laboratories | SP-8400 | |
C2C12 cell line | ATCC | CRL-1772 | |
Centrifuge | Unico | C8606 | |
Change-A-Tip High Temp Cauteries | Bovie Medical Corporation | HIT | |
Confocal microscopy | Zeiss | Zeiss 780 Upright Confocal | |
DBA/2J-mdx mice | The Jackson Laboratory | 013141 | |
DMEM | Corning | 10-013-CM | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-011-CV | |
Goat serum | MP Biomedicals, LLC | 191356 | |
Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
Ketamine | Henry Schein | 056344 | |
Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
Mouse Retractor Set | Kent Scientific | SURGI-5001 | |
Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether | Fisher Scientific | BP151-100 | |
Rodent ventilator | Harvard Apparatus | 55-7066 | |
SW-28 Ti rotor | Beckman | 342207 | |
The Vevo 2100 Imaging Platform | FUJIFILM VisualSonics | Vevo 2100 | Ultrasound System |
Ultracentrifuge | Beckman | 365672 | |
Ultra-Clear Tubes | Beckman | 344058 | |
Xylazine (XylaMed) | Bimeda-MTC Animal Health Inc. | 1XYL003 8XYL006 |