Özet

Визуализация глазной борозды Superior во время эмбриогенеза данио рерио

Published: March 27, 2019
doi:

Özet

Здесь мы представляем серию стандартизированных протоколов для наблюдения за Улучшенный глазной борозды, недавно выявленных, эволюционно сохраняется структура в позвоночных глаз. С помощью данио рерио личинки, мы демонстрируем методов, необходимых для выявления факторов, влияющих на формирование и закрытие Улучшенный глазной борозды.

Abstract

Врожденная колобома глазной это генетическое нарушение, которое обычно наблюдается как расщелина в нижней аспект глаза результате неполной сосудистое трещина закрытия. Недавно выявление лиц с колобома в Улучшенный аспекте Ирис, сетчатке и объектив, привели к открытию новой структуры, называется Улучшенный трещина или Улучшенный глазной борозды (SOS), который временно присутствует на дорсальной аспект глазного бокала во время развития позвоночных глаз. Хотя эта структура сохраняется через мышей, цыпленок, рыбы и Тритон, нашего нынешнего понимания особенностей SOS ограничен. Для того, чтобы разъяснить факторы влияющие на его формирование и закрытия, крайне важно, чтобы иметь возможность наблюдать это и выявления аномалий, таких, как задержки в закрытии SOS. Здесь мы намереваемся создать серию стандартизированных протоколов, которые могут быть использованы эффективно визуализировать SOS путем объединения методов широко доступны микроскопии с общие методы молекулярной биологии как immunofluorescent окрашивание и мРНК Гиперэкспрессия. Хотя этот набор протоколов фокусируется на способность наблюдать за задержку закрытия SOS, он адаптируется к потребностям экспериментатора и могут быть легко изменены. В целом мы надеемся создать доступный метод, через который наше понимание SOS можно дополнительно расширить текущий набор знаний развития позвоночных глаз.

Introduction

Формирование позвоночных глаз является весьма сохранены процесс в котором тщательно спланированных межклеточной сигнализации пути установить типы тканей и указать региональной идентичности1. Возмущений в начале глаз морфогенеза приводят к глубокие дефекты в архитектуре глаза и часто слепоте2. Один из таких заболеваний результаты от неспособности закрыть сосудистое глазной щели в брюшной части глазного бокала3. Это расстройство, известный как глазные колобома, оценивается в 1 из 4-5000 живорожденных и причиной детской слепоты, часто проявляется как замочной скважины как структура, которая выступала книзу от ученика в центре глаза4, 3-11% 5,6. Функцию сосудистого трещина является предоставляют точку входа для раннего сосудистую, врастают в глазного бокала, после чего стороны трещины будет предохранитель подложить судов7.

В то время как глазные колобома был известен с древних времен, мы определили недавно подмножество Роман колобома пациентов с потерей ткани, затрагивающих Улучшенный/спинной части глаза. Последние работы в нашей лаборатории привела к открытию глазной структуры в спинной глаза данио рерио, который мы называем Улучшенный глазной борозды (SOS) или Улучшенный трещина8. Важно отметить, что структура имеет характеристики борозды и фиссур. Подобно борозды, это постоянное ткани слой, который охватывает от носа до височной сетчатки. Кроме того закрытие структуры не опосредовано слияние двух противоположных базальной мембраны, и она, как представляется, требуют морфогенетических процесс, в котором структура заполняется клетками. Однако подобно трещина, он образует структуру, которая отделяет носовой и височной стороны спинной глаз с базальной мембраны. Для обеспечения согласованности мы будет ссылаться на него как SOS в этом тексте.

SOS эволюционно сохраняется через позвоночных, будучи видимыми в ходе морфогенеза глаз рыбы, куриных, Тритон и мыши8. В отличие от сосудистое трещина, которая присутствует от 20-60 часов после оплодотворения (hpf) в данио рерио, SOS весьма преходящими, будучи легко видны с 20-23 hpf и отсутствует 26 hpf8. Недавние исследования в нашей лаборатории обнаружил, что, подобно сосудистое трещина, SOS играет роль в сосудистой руководство во время глаз морфогенеза8. Хотя факторы, определяющие формирование и закрытие SOS еще полностью не поняты, наши данные выделить ролей для глаз спинной вентральный кучность генов8.

Данио рерио — организм отличную модель для изучения SOS. Как модель системы, он обеспечивает ряд преимуществ при изучении глаз развития: это позвоночных модель; Каждое поколение проявляет высокую плодовитость (~ 200 эмбрионов); полностью виртуализированных его генома, который облегчает генетические манипуляции; и примерно 70% генов человека имеют по крайней мере один orthologue данио рерио, что делает его идеальным модель на основе генетики человека болезни9,10. Самое главное ее развитие происходит извне для матери, и его личинки являются прозрачными, что позволяет для визуализации развивающихся глаза с относительной легкостью11.

В этом наборе протоколов мы описываем методы, через которые SOS могут быть визуализированы в zebrafish личинки. Разнообразие методов визуализации, используемые в настоящем докладе позволит четкое наблюдение SOS во время разработки нормальный глаз, а также способность обнаруживать SOS закрытия дефектов. Наш пример протоколы будут представлены исследования Gdf6, BMP локализованные в спинной глаз и известных регулятор SOS закрытия. Кроме того эти методы могут быть объединены с экспериментальных манипуляций для выявления генетических факторов или фармакологических агентов, которые влияют на формирование надлежащего SOS и закрытия. Кроме того мы включили протокол, посредством которого возможна флуоресцентных изображений всех клеточных мембран, позволяя экспериментатор соблюдать морфологические изменения клеток, окружающих SOS. Наша цель – создать набор стандартизованных протоколов, которые могут использоваться на протяжении всего научного сообщества предложить новые идеи в этот роман структуры развивающихся глаза.

Protocol

Все методы, описанные здесь были одобрены в университете Альберта животное уход и использование Комитета. 1. Протокол 1: Визуализация SOS, используя стереомикроскопия и дифференциальной помехи изображения контрастность (DIC) Эмбрион коллекция В баке дехлорируемым…

Representative Results

Данио рерио SOS появляется в 20 hpf предполагаемого спинной сетчатки8. 23 hpf SOS переходы от его первоначального узкого архитектуры для широкого отступы и 26 hpf, это больше не видны8. Таким образом для изучения SOS во время разработки глаз обычных данио р…

Discussion

Здесь мы представляем серию стандартизированных протоколов соблюдать SOS в развивающихся zebrafish эмбриона. Чтобы определить закрытие задержки фенотипов, наши протоколы были сосредоточены на способность различать разделение двух дискретных долей спинной носовой и спинной височной стор?…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана канадской институты здравоохранения исследований (КНИИЗ), естественных наук и инженерных исследований Совета (СЕНТИ), Альберта инновационную технологию фьючерсы и женщин и Институт исследований здоровья детей (WCHRI).

Materials

1-phenyl 2-thiourea Sigma Aldrich P7629-10G
100 mm Petri dish Fisher Scientific FB0875713
35 mm Petri dish Corning CLS430588
Agarose BioShop Canada Inc. AGA001.1
Bovine serum albumin Sigma Aldrich A7906-100G
DIC/Fluorescence microscope Zeiss AxioImager Z1
Dissection microscope Olympus SZX12
Dissection microscope camera Qimaging MicroPublisher 5.0 RTV
Dow Corning High-vacuum grease Fisher Scientific 14-635-5D
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) Sigma Aldrich A5040-25G
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 Abcam ab150077
Goat serum Sigma Aldrich G9023
Image capture software Zeiss ZEN
Incubator VWR Model 1545
Microscope Cover Glass (22 mm x 22 mm) Fisher Scientific 12-542B
Microscope slide Fisher Scientific 12-544-2
Minutien pin Fine Science Tools 26002-10
mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit Invitrogen AM1340
NotI New England Biolabs R0189S
Paraformaldehyde (PFA) Sigma Aldrich P6148-500G
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol pH 6.7 +/- 0.2 Fisher Scientific BP1752-100
Proteinase K Sigma Aldrich P4850
Rabbit anti-laminin antibody Millipore Sigma L9393
TURBO Dnase (2 U/µL) Invitrogen AM2238
Ultrapure low-melting point agarose Invitrogen 16520-100
UltraPure Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Invitrogen 15525017

Referanslar

  1. Chow, R. L., Lang, R. A. Early eye development in vertebrates. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 17, (2001).
  2. Slavotinek, A. M. Eye development genes and known syndromes. Molecular Genetics and Metabolism. 104 (448-456), (2011).
  3. Gregory-Evans, C. Y., Williams, M. J., Halford, S., Gregory-Evans, K. Ocular coloboma: a reassessment in the age of molecular neuroscience. Journal of Medical Genetics. 41 (12), (2004).
  4. Onwochei, B. C., Simon, J. W., Bateman, J. B., Couture, K. C., Mir, E. Ocular colobomata. Survey of Ophthalmolgy. 45, 175-194 (2000).
  5. Williamson, K. A., FitzPatrick, D. R. The genetic architecture of microphthalmia, anophthalmia and coloboma. European Journal of Medical Genetics. 57, 369-380 (2014).
  6. Chang, L., Blain, D., Bertuzzi, S., Brooks, B. P. Uveal coloboma: clinical and basic science update. Current Opinion in Ophthalmology. 17, 447-470 (2006).
  7. Kaufman, R., et al. Development and origins of Zebrafish ocular vasculature. BMC Developmental Biology. 15 (18), (2015).
  8. Hocking, J. C., et al. Morphogenetic defects underlie Superior Coloboma, a newly identified closure disorder of the dorsal eye. PLOS Genetics. 14 (3), (2018).
  9. Lawson, N. D., Wolfe, S. A. Forward and reverse genetic approaches for the analysis of vertebrate development in the zebrafish. Developmental Cell. 21 (1), (2011).
  10. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), (2013).
  11. Bilotta, J., Saszik, S. The zebrafish as a model visual system. International Journal of Developmental Neuroscience. 19, 621-629 (2001).
  12. Westerfield, M. . The Zebrafish Book; A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2007).
  13. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).
  14. Distel, M., Köster, R. W. In vivo time-lapse imaging of zebrafish embryonic development. Cold Spring Harbor Protocols. , (2007).
  15. Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3, 59-69 (2008).
  16. Kwan, K. M., Otsuna, H., Kidokoro, H., Carney, K. R., Saijoh, Y., Chien, C. A complex choreography of cell movements shapes the vertebrate eye. Development. 139, 359-372 (2012).
  17. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullman, B., Schilling, T. F. Stages of Embryonic Development of the Zebrafish. Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).
  18. Gfrerer, L., Dougherty, M., Liao, E. C. Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (79), e50525 (2013).
  19. Percival, S. M., Parant, J. M. Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo. J. Vis. Exp. (113), e54218 (2016).

Play Video

Bu Makaleden Alıntı Yapın
Yoon, K. H., Widen, S. A., Wilson, M. M., Hocking, J. C., Waskiewicz, A. J. Visualization of the Superior Ocular Sulcus during Danio rerio Embryogenesis. J. Vis. Exp. (145), e59259, doi:10.3791/59259 (2019).

View Video