Özet

ויזואליזציה של Sulcus עינית הממונה במהלך מופרה רזבורה rerio

Published: March 27, 2019
doi:

Özet

כאן, אנו מציגים סדרה סטנדרטית של פרוטוקולים להתבונן sulcus עינית, נעלה את מבנה שזוהתה לאחרונה, והתפאורה אבולוציונית בעיניים חוליות. באמצעות רימות דג זברה, נדגים טכניקות הדרושות כדי לזהות גורמים שתורמים היווצרות וסגירת sulcus עינית מעולה.

Abstract

Coloboma עינית מולדת היא הפרעה גנטית זה בדרך כלל נצפית כמו בקע בהיבט נחות של העין הסגר פיסורה דמית העין לא שלם. לאחרונה, הזיהוי של אנשים עם coloboma בהיבט מעולה של איריס, רשתית, עדשה הובילו הגילוי של מבנה הרומן, מכונה מעולה פיסורה או sulcus עינית סופריור (SOS), כי קיים transiently על מהראש ההיבט של גביע הראייה במהלך התפתחות העין חוליות. למרות המבנה כולו על פני עכברים, חומוס, דג, ניוט, ההבנה הנוכחית שלנו של אות המצוקה היא מוגבלת. כדי להבהיר גורמים שתורמים שלה היווצרות, הסגר, זה הכרחי כדי שניתן יהיה לבחון אותה ולזהות מומים, כגון עיכוב הסגר ה’אס. כאן, אנחנו יצא כדי ליצור סדרה סטנדרטית של פרוטוקולים יכול לשמש ביעילות להמחיש אות המצוקה על ידי שילוב של טכניקות במיקרוסקופ נרחב זמין עם טכניקות ביולוגיה מולקולרית נפוצות כגון צביעת immunofluorescent mRNA ביטוי. בעוד זו קבוצה של פרוטוקולים מתמקד היכולת להתבונן SOS הסגר עיכוב, היא יכולת הסתגלות לצרכים של הנסיין, ניתן לשנות בקלות. בסך הכל, אנו מקווים ליצור שיטה נוחה שדרכו ניתן מתקדמים ההבנה שלנו של אות המצוקה כדי להרחיב את הידע הנוכחי של התפתחות העין חוליות.

Introduction

היווצרות של העין חוליות הוא תהליך מאוד שנשמרת בו מתוזמר בקפידה איתות המסלולים המערכת לקבוע סוגי רקמות, ציין הזהות האזורית1. לפליטת עד תחילת מורפוגנזה עין לגרום פגמים מעמיקה הארכיטקטורה של העין, לעתים קרובות מסנוור2. מחלה אחד כזה נובע הכשל כדי לסגור את פיסורה עינית דמית העין בצד הגחוני של גביע אופטיים3. הפרעה זו, המכונה coloboma עינית, מעריכים כי ב- 1 מתוך 4-5000 לידות חי ו- % 3-11 לגרום לעיוורון בילדים, מפגין נפוץ כמו מבנה דמוי מנעול זה בולטת האישון במרכז עין4, נלסון! 5,6. הפונקציה של פיסורה דמית העין היא כדי לספק נקודת כניסה מוקדמת להערכת גדל לתוך הכוס אופטיים, לאחר מכן צידי פיסורה הפתיל כדי להקיף את כלי7.

בעוד coloboma עינית ידוע מאז ימי קדם, לאחרונה זיהינו תת-קבוצה הרומן של coloboma חולים עם איבוד רקמות המשפיעים על ההיבט סופריור/הגבי של העין. עבודה במעבדה שלנו הובילה לגילוי של מבנה עינית בעין דג זברה הגבי, שאותם אנו מכנים sulcus עינית סופריור (SOS) או פיסורה מעולה8. חשוב לציין כי המבנה יש מאפייני sulcus והן סדק. בדומה sulcus, זה שכבת רקמת מתמיד החובקת מ אפי אל הרשתית טמפורלית. בנוסף, הסגר של המבנה שאינו מתווך על ידי שילוב של השניים מנוגדים קרום המרתף, ונראה לדרוש morphogenetic תהליך שבו המבנה מאוכלס על ידי התאים. עם זאת, בדומה סדק, היא יוצרת מבנה המפריד את האף ובצד הטמפורלי של העין הגבי עם קרום המרתף. עקביות, נתייחס אליו כמו SOS בטקסט זה.

אות המצוקה אבולוציונית כולו לאורך החוליות, להיות גלוי במהלך מורפוגנזה עין דג, צ’יק, ניוט ו העכבר8. בניגוד פיסורה דמית העין, אשר נמצא במקום מ- 20-60 שעות שלאחר ההפריה (hpf) בדג זברה, אות המצוקה הוא מאוד חולף, להיות גלויים בקלות מ- 20-23 hpf, נעדר מאת 26 hpf8. מחקר שנערך לאחרונה במעבדתנו נמצא כי, בדומה פיסורה דמית העין, אות המצוקה ממלאת תפקיד הדרכה כלי הדם בזמן העין מורפוגנזה8. למרות הגורמים השולטים על היווצרות וסגירת אות המצוקה אינם עדיין לגמרי מובנים, הנתונים שלנו הדגש תפקידי עין הגבי הגחוני / תכנים גנים8.

דג זברה היא אורגניזם מודל מצויין ללמוד אות המצוקה. כמערכת מודל, היא מספקת מספר יתרונות בלימוד התפתחות העין: זה מודל חוליות; כל דור תערוכות פוריות גבוהה (~ 200 עוברי); הגנום שלו יש כבר וסודרו באופן מלא, אשר מקלה על מניפולציה גנטית; כ- 70% של גנים אנושיים יש לפחות אחד orthologue דג זברה, שהופך אותו מודל אידיאלי מבוסס-גנטיקה של מחלות אנושיות9,10. והכי חשוב, התפתחותו לוקח מקום חיצוני עם האמא, הזחלים שלה הם שקופים, מה שמאפשר עבור הפריט החזותי של העין לפתח בקלות יחסית11.

בקבוצה זו של פרוטוקולים, נתאר את הטכניקות שדרכו ניתן לאבחן אות המצוקה של דג זברה הזחלים. מגוון רחב של טכניקות הדמיה השתמשו בדוח זה יאפשר התבוננות ברור ה’אס במהלך התפתחות העין נורמלי, כמו גם את היכולת לזהות פגמים הסגר SOS. הפרוטוקולים בדוגמה שלנו יכלול חקירות של Gdf6, BMP מקומית מהראש ועין וסת הידועות של SOS הסגר. יתרה מזאת, טכניקות אלה יכול להיות משולב עם ניסיוני מניפולציות כדי לזהות גורמים גנטיים או סוכנים תרופתי המשפיעים על היווצרות SOS הנכונה וסגירת. בנוסף, כללנו פרוטוקול שדרכו אפשרית ההדמיה פלורסנט של כל קרום התא, המאפשר הנסיין לבחון שינויים מורפולוגיים לתאים שסביבה אות המצוקה. המטרה שלנו היא להקים קבוצה של פרוטוקולים סטנדרטיים יכול לשמש בכל רחבי הקהילה המדעית להציע תובנות חדשות זה מבנה הרומן של העין המתפתח.

Protocol

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי אוניברסיטת אלברטה חיה אכפת והוועדה שימוש. 1. פרוטוקול 1: ויזואליזציה של SOS באמצעות stereomicroscopy ודימות ניגודיות (DIC) התערבות דיפרנציאלית אוסף העובר בתוך מיכל מים dechlorinated, הכן חוצה של gdf6a+ /- דג זברה בשעות הערב על ידי זיווג דג ז?…

Representative Results

דג זברה SOS מופיע בגיל 20 hpf ב רשתית הגבי הרב, שעורר8. 23 hpf אות המצוקה מעברים מן הארכיטקטורה צר הראשונית כניסה רחב ועל ידי 26 hpf. זה כבר לא נראה לעין8. לכן, כדי לבחון את SOS במהלך התפתחות העין נורמלי דג זברה, העוברים יש להקפיד בין hpf 20-23. במהלך תקופה זו, הוא או?…

Discussion

כאן, אנו מציגים סדרה סטנדרטית של פרוטוקולים להתבונן על המצוקה של העובר המתפתח דג זברה. כדי לקבוע פנוטיפים עיכוב הסגר, פרוטוקולים שלנו התמקדו היכולת להבחין בהפרדה בין שתי האונות דיסקרטית של הצד הגבי-אפיים ואת הגבי-טמפורלית של העין, דומה טכניקות השתמשו כדי להמחיש פיסורה דמית העין הסגר עיכוב…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי קנדי מוסדות של הבריאות מחקר (CIHR), מדעי הטבע, המועצה מחקר הנדסי (NSERC), אלברטה מתפתחת טכנולוגיה עתידיות, ונשים, מכון מחקר בריאות (WCHRI לילדים).

Materials

1-phenyl 2-thiourea Sigma Aldrich P7629-10G
100 mm Petri dish Fisher Scientific FB0875713
35 mm Petri dish Corning CLS430588
Agarose BioShop Canada Inc. AGA001.1
Bovine serum albumin Sigma Aldrich A7906-100G
DIC/Fluorescence microscope Zeiss AxioImager Z1
Dissection microscope Olympus SZX12
Dissection microscope camera Qimaging MicroPublisher 5.0 RTV
Dow Corning High-vacuum grease Fisher Scientific 14-635-5D
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) Sigma Aldrich A5040-25G
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 Abcam ab150077
Goat serum Sigma Aldrich G9023
Image capture software Zeiss ZEN
Incubator VWR Model 1545
Microscope Cover Glass (22 mm x 22 mm) Fisher Scientific 12-542B
Microscope slide Fisher Scientific 12-544-2
Minutien pin Fine Science Tools 26002-10
mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit Invitrogen AM1340
NotI New England Biolabs R0189S
Paraformaldehyde (PFA) Sigma Aldrich P6148-500G
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol pH 6.7 +/- 0.2 Fisher Scientific BP1752-100
Proteinase K Sigma Aldrich P4850
Rabbit anti-laminin antibody Millipore Sigma L9393
TURBO Dnase (2 U/µL) Invitrogen AM2238
Ultrapure low-melting point agarose Invitrogen 16520-100
UltraPure Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Invitrogen 15525017

Referanslar

  1. Chow, R. L., Lang, R. A. Early eye development in vertebrates. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 17, (2001).
  2. Slavotinek, A. M. Eye development genes and known syndromes. Molecular Genetics and Metabolism. 104 (448-456), (2011).
  3. Gregory-Evans, C. Y., Williams, M. J., Halford, S., Gregory-Evans, K. Ocular coloboma: a reassessment in the age of molecular neuroscience. Journal of Medical Genetics. 41 (12), (2004).
  4. Onwochei, B. C., Simon, J. W., Bateman, J. B., Couture, K. C., Mir, E. Ocular colobomata. Survey of Ophthalmolgy. 45, 175-194 (2000).
  5. Williamson, K. A., FitzPatrick, D. R. The genetic architecture of microphthalmia, anophthalmia and coloboma. European Journal of Medical Genetics. 57, 369-380 (2014).
  6. Chang, L., Blain, D., Bertuzzi, S., Brooks, B. P. Uveal coloboma: clinical and basic science update. Current Opinion in Ophthalmology. 17, 447-470 (2006).
  7. Kaufman, R., et al. Development and origins of Zebrafish ocular vasculature. BMC Developmental Biology. 15 (18), (2015).
  8. Hocking, J. C., et al. Morphogenetic defects underlie Superior Coloboma, a newly identified closure disorder of the dorsal eye. PLOS Genetics. 14 (3), (2018).
  9. Lawson, N. D., Wolfe, S. A. Forward and reverse genetic approaches for the analysis of vertebrate development in the zebrafish. Developmental Cell. 21 (1), (2011).
  10. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), (2013).
  11. Bilotta, J., Saszik, S. The zebrafish as a model visual system. International Journal of Developmental Neuroscience. 19, 621-629 (2001).
  12. Westerfield, M. . The Zebrafish Book; A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2007).
  13. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).
  14. Distel, M., Köster, R. W. In vivo time-lapse imaging of zebrafish embryonic development. Cold Spring Harbor Protocols. , (2007).
  15. Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3, 59-69 (2008).
  16. Kwan, K. M., Otsuna, H., Kidokoro, H., Carney, K. R., Saijoh, Y., Chien, C. A complex choreography of cell movements shapes the vertebrate eye. Development. 139, 359-372 (2012).
  17. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullman, B., Schilling, T. F. Stages of Embryonic Development of the Zebrafish. Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).
  18. Gfrerer, L., Dougherty, M., Liao, E. C. Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (79), e50525 (2013).
  19. Percival, S. M., Parant, J. M. Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo. J. Vis. Exp. (113), e54218 (2016).

Play Video

Bu Makaleden Alıntı Yapın
Yoon, K. H., Widen, S. A., Wilson, M. M., Hocking, J. C., Waskiewicz, A. J. Visualization of the Superior Ocular Sulcus during Danio rerio Embryogenesis. J. Vis. Exp. (145), e59259, doi:10.3791/59259 (2019).

View Video