Özet

Visualisation du sillon oculaire supérieure durant l’embryogenèse Danio rerio

Published: March 27, 2019
doi:

Özet

Nous présentons ici une série standardisée des protocoles d’observer le sillon oculaire supérieur, une structure récemment identifiés, évolutivement conservée dans le œil de vertébrés. À l’aide de larves de poisson zèbre, nous démontrons techniques nécessaires pour identifier les facteurs qui contribuent à la formation et la fermeture du sillon oculaire supérieur.

Abstract

Colobome oculaire congénital est une maladie génétique qui est généralement observée comme une fissure dans l’aspect inférieur de le œil résultant de la fermeture incomplète fissure choroïde. Récemment, l’identification des individus avec colobome dans l’aspect supérieur de l’iris, rétine et lentille a conduit à la découverte d’une nouvelle structure, dénommée la fissure supérieure ou sillon oculaire supérieur (SOS), qui est transitoirement présent sur la partie dorsale aspect de la cupule optique au cours du développement de le œil de vertébrés. Bien que cette structure est conservée à travers la souris, poulet, poisson et newt, notre compréhension actuelle du re est limitée. Afin d’élucider les facteurs qui contribuent à sa formation et de la fermeture, il est impératif de pouvoir observer et identifier les anomalies, tels que le retard dans la fermeture du re. Ici, nous avons décidé de créer une série normalisée de protocoles qui permet de visualiser efficacement le SOS en combinant des techniques de microscopie largement disponibles avec des techniques de biologie moléculaire commun tels que la coloration par immunofluorescence et ARNm surexpression. Bien que cet ensemble de protocoles porte sur la possibilité d’observer le retard de fermeture de SOS, il s’adapte aux besoins de l’expérimentateur et peut être facilement modifié. Dans l’ensemble, nous espérons créer une méthode accessible à travers lequel notre compréhension du re peut être avancée afin d’élargir les connaissances actuelles du développement de le œil de vertébrés.

Introduction

La formation de le œil de vertébrés est un processus hautement conservé dans lequel les voies de signalisation intercellulaires soigneusement orchestrées établissent les types de tissus et spécifient l’identité régionale1. Perturbations au début morphogenèse oeil entraîner des défauts profonds à l’architecture de le œil et sont fréquemment aveuglantes2. Une telle maladie résulte de l’omission de fermer la fissure choroïde oculaire dans la partie ventrale de la cupule optique3. Cette affection, appelée colobome oculaire, est estimée à se produire dans 1 sur 4-5000 naissances vivantes et cause 3 à 11 % de la cécité pédiatrique, communément se manifestant par une structure de type trou de serrure qui fait saillie inférieurement de l’élève au centre de l’oeil4, 5,6. La fonction de la fissure choroïde est de fournir un point d’entrée pour début vascularisation de plus en plus dans la cupule optique, après quoi les côtés de la fissure vont se fusionnent pour enfermer les vaisseaux7.

Alors que le colobome oculaire est connu depuis les temps anciens, nous avons récemment identifié un nouveau sous-ensemble de colobome patients avec perte de tissu qui affectent l’aspect supérieur/dorsale de le œil. Des travaux récents dans notre laboratoire a conduit à la découverte d’une structure oculaire dans le œil de poisson-zèbre dorsale, que nous appelons le sillon oculaire supérieur (SOS) ou fissure supérieure8. Il est important de noter que la structure présente des caractéristiques d’un sillon tant une fissure. Semblable à un sillon, c’est une couche de tissu continu qui s’étend de la nasale de la rétine temporale. En outre, la fermeture de la structure n’est pas véhiculée par une fusion des deux s’opposant à membrane basale, et il semble avoir besoin d’un processus morphogénétique par lequel la structure est remplie de cellules. Cependant, comme dans une fissure, il forme une structure qui sépare les parties nasales et temporelles de le œil dorsale avec la membrane basale. Par souci de cohérence, nous appellerons à elle comme SOS dans ce texte.

Le SOS est évolutivement conservée à travers des vertébrés, étant visible durant la morphogenèse oeil de poisson, poussin, Triton et souris8. Contrairement à la fissure choroïde, qui est présente de 20 à 60 heures après la fécondation (hpf) chez le poisson zèbre, le SOS est très transitoire, étant facilement visible de 20-23 hpf et absent par 26 hpf8. Des études récentes dans notre laboratoire ont révélé que, semblable à la fissure choroïde, le SOS joue un rôle dans une conduite vasculaire au cours de le œil la morphogenèse8. Bien que les facteurs qui contrôlent la formation et la fermeture du re ne sont pas encore totalement comprises, nos données mettent en évidence les rôles pour oeil dorsal-ventral patterning gènes8.

Poisson zèbre est un organisme d’excellent modèle pour étudier la SOS. Comme système modèle, il fournit un certain nombre d’avantages dans l’étude de développement de le œil : C’est un modèle de vertébrés ; chaque génération présente forte fécondité (~ 200 embryons) ; son génome a été entièrement séquencé, ce qui facilite la manipulation génétique ; et environ 70 % des gènes humains ont au moins un orthologue de poisson-zèbre, ce qui en fait un modèle idéal de base génétique des maladies humaines9,10. Plus important encore, son développement se déroule à l’extérieur à la mère, et ses larves sont transparentes, ce qui permet la visualisation de le œil en développement avec la facilité relative de11.

Dans cet ensemble de protocoles, les auteurs décrivent les techniques à travers lequel le SOS peuvent être visualisées dans des larves de poisson zèbre. La variété des techniques de visualisation utilisé dans le présent rapport permettra l’observation claire du re au cours du développement de l’oeil normal, ainsi que la capacité de détecter les défauts de fermeture de SOS. Nos protocoles d’exemple mettra en vedette des enquêtes de Gdf6, un BMP localisée à la partie dorsale oeil et régulateur connu de fermeture de SOS. En outre, ces techniques peuvent être associés à des manipulations expérimentales afin d’identifier les facteurs génétiques ou des agents pharmacologiques qui affectent la fermeture et la bonne formation de SOS. En outre, nous avons inclus un protocole par lequel l’imagerie fluorescente de toutes les membranes cellulaires est possible, permettant à l’expérimentateur d’observer les changements morphologiques pour les cellules qui entourent les SOS. Notre objectif est d’établir un ensemble de protocoles normalisés qui permet d’offrir de nouvelles perspectives sur cette nouvelle structure de l’oeil en développement dans l’ensemble de la communauté scientifique.

Protocol

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’Université de l’Alberta animalier et Comité d’urbanisme. 1. le protocole 1 : Visualisation de SOS à l’aide de stéréomicroscopie et imagerie (DIC) de contraste interférentiel différentiel Collecte des embryons Dans un réservoir d’eau déchlorée, préparer des croisements de gdf6a+/- zebrafish le soir en couplant un poisson-zèbre mâle avec une femelle poisson-zèbre. N’oub…

Representative Results

Le poisson-zèbre SOS apparaît à 20 hpf dans la rétine dorsale présomptive8. Par 23 hpf le SOS transitions de son architecture initiale étroit à une large échancrure et 26 hpf, il n’est donc plus visible8. Par conséquent, afin d’examiner le SOS au cours du développement d’oeil de poisson zèbre normal, les embryons doivent être observées entre hpf 20-23. Durant cette période, le SOS est observable par le microscope à disse…

Discussion

Nous présentons ici une série standardisée des protocoles d’observer les SOS dans l’embryon de poisson zèbre en développement. Pour déterminer les phénotypes de retard fermeture, nos protocoles ont mis l’accent sur la capacité de distinguer la séparation de deux lobes distincts des côtés dorsal-nasal et dorsale-temporal de le œil, semblable aux techniques permettant de visualiser le retard de fermeture de fissure choroïde phénotypes dans l’oeil ventral.

Ces techniques de …

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par les instituts de recherche en santé du Canada (IRSC), Sciences naturelles et Conseil de recherches en génie (CRSNG), Alberta Innovates Technology Futures et les femmes et Health Research Institute (WCHRI enfants).

Materials

1-phenyl 2-thiourea Sigma Aldrich P7629-10G
100 mm Petri dish Fisher Scientific FB0875713
35 mm Petri dish Corning CLS430588
Agarose BioShop Canada Inc. AGA001.1
Bovine serum albumin Sigma Aldrich A7906-100G
DIC/Fluorescence microscope Zeiss AxioImager Z1
Dissection microscope Olympus SZX12
Dissection microscope camera Qimaging MicroPublisher 5.0 RTV
Dow Corning High-vacuum grease Fisher Scientific 14-635-5D
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) Sigma Aldrich A5040-25G
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 Abcam ab150077
Goat serum Sigma Aldrich G9023
Image capture software Zeiss ZEN
Incubator VWR Model 1545
Microscope Cover Glass (22 mm x 22 mm) Fisher Scientific 12-542B
Microscope slide Fisher Scientific 12-544-2
Minutien pin Fine Science Tools 26002-10
mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit Invitrogen AM1340
NotI New England Biolabs R0189S
Paraformaldehyde (PFA) Sigma Aldrich P6148-500G
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol pH 6.7 +/- 0.2 Fisher Scientific BP1752-100
Proteinase K Sigma Aldrich P4850
Rabbit anti-laminin antibody Millipore Sigma L9393
TURBO Dnase (2 U/µL) Invitrogen AM2238
Ultrapure low-melting point agarose Invitrogen 16520-100
UltraPure Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Invitrogen 15525017

Referanslar

  1. Chow, R. L., Lang, R. A. Early eye development in vertebrates. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 17, (2001).
  2. Slavotinek, A. M. Eye development genes and known syndromes. Molecular Genetics and Metabolism. 104 (448-456), (2011).
  3. Gregory-Evans, C. Y., Williams, M. J., Halford, S., Gregory-Evans, K. Ocular coloboma: a reassessment in the age of molecular neuroscience. Journal of Medical Genetics. 41 (12), (2004).
  4. Onwochei, B. C., Simon, J. W., Bateman, J. B., Couture, K. C., Mir, E. Ocular colobomata. Survey of Ophthalmolgy. 45, 175-194 (2000).
  5. Williamson, K. A., FitzPatrick, D. R. The genetic architecture of microphthalmia, anophthalmia and coloboma. European Journal of Medical Genetics. 57, 369-380 (2014).
  6. Chang, L., Blain, D., Bertuzzi, S., Brooks, B. P. Uveal coloboma: clinical and basic science update. Current Opinion in Ophthalmology. 17, 447-470 (2006).
  7. Kaufman, R., et al. Development and origins of Zebrafish ocular vasculature. BMC Developmental Biology. 15 (18), (2015).
  8. Hocking, J. C., et al. Morphogenetic defects underlie Superior Coloboma, a newly identified closure disorder of the dorsal eye. PLOS Genetics. 14 (3), (2018).
  9. Lawson, N. D., Wolfe, S. A. Forward and reverse genetic approaches for the analysis of vertebrate development in the zebrafish. Developmental Cell. 21 (1), (2011).
  10. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), (2013).
  11. Bilotta, J., Saszik, S. The zebrafish as a model visual system. International Journal of Developmental Neuroscience. 19, 621-629 (2001).
  12. Westerfield, M. . The Zebrafish Book; A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2007).
  13. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).
  14. Distel, M., Köster, R. W. In vivo time-lapse imaging of zebrafish embryonic development. Cold Spring Harbor Protocols. , (2007).
  15. Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3, 59-69 (2008).
  16. Kwan, K. M., Otsuna, H., Kidokoro, H., Carney, K. R., Saijoh, Y., Chien, C. A complex choreography of cell movements shapes the vertebrate eye. Development. 139, 359-372 (2012).
  17. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullman, B., Schilling, T. F. Stages of Embryonic Development of the Zebrafish. Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).
  18. Gfrerer, L., Dougherty, M., Liao, E. C. Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (79), e50525 (2013).
  19. Percival, S. M., Parant, J. M. Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo. J. Vis. Exp. (113), e54218 (2016).

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Yoon, K. H., Widen, S. A., Wilson, M. M., Hocking, J. C., Waskiewicz, A. J. Visualization of the Superior Ocular Sulcus during Danio rerio Embryogenesis. J. Vis. Exp. (145), e59259, doi:10.3791/59259 (2019).

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