Burada yüksek üretilen iş algılama ve fucosylated insan sütü oligosakkaritler (HMOs), tüm hücreli Biyoalgılayıcı kullanarak miktar açıklayın. Biz de burada, bu platform HMO üretim suşları, analizini doğru uyarlaması gürültü oranı sinyal geliştirmeye odaklanan göstermek.
İnsan sütü oligosakkaritler (HMOs) bebek sağlığı üzerinde bol yararları sorun oluşturan kompleks karbonhidrat bileşenleri insan anne sütü vardır. Ancak, onların Biyoteknolojik sentez duruma getirilmesi nispeten düşük akış verimi, algılama ve miktar yaşam ve bağlantıları sınırlıdır. Glycan analiz geleneksel teknikleri ile geçerek örnekleri otomasyon olmadan günde yüzlerce sırasına Kromatografik/kütle-spektrometrik yöntemleri içerir. Biz burada, yüksek işlem hacmi, bağlantı özel algılama ve miktar fucosylated HMO yapıları, 2′-fucosyllactose ve 3-fucosyllactose, biz Contegra yoluyla elde için genetik olarak kodlanmış bir bakteriyel Biyoalgılayıcı göstermek fucosidases ifadesidir. Laktoz süt veya Biyoteknolojik süreçler varlığı için yanlış pozitif neden olabilir gibi aynı zamanda farklı stratejiler kullanarak laktoz sinyal azalma göstermektedir. Bu teknik en yüksek üretimi nedeniyle, birçok reaksiyon koşulları veya biyoreaktör parametrelerini paralel HMO üretim optimizasyonu için izin saatlik bir konuda denetlesinler.
İnsan sütü oligosakkaritler (HMOs) genellikle 3-8 şeker monomerleri oluşan oligosakkaritler, laktoz kaynaklı vardır. Onlar bir Laktoz (Gal-β1, 4-Glc) sona azaltmak ve daha fazla glycosidic bağlantılarıyla uzamıştır (β-1,3 – veya β-1,6-) (Glc) glikoz, galaktoz (Gal) veya N-peptidoglikan (GlcNAc). Buna ek olarak, fucose (Fuc, α-1, 2 veya α 1,3-) veya sialik asit (SIA veya NeuAc, α-2, 3 veya α 2,6-) artıkları kez1eklendi.
Geçerli analiz oligosakkaritler ve diğer karbonhidratlar Kromatografik/kütle spektrometrik (MS) teknolojisi2,3,4,5, için ihtiyaç ile üretilen iş ve kapsam içinde sınırlıdır 6 , hangi-ebilmek almak kabaca 7, pahalı donanımları, özel sütun ve saptırma ajanlar ve uzmanlık Bu ekipman8operasyonunda bahsetmiyorum örnek başına bir saat. Oligosakkarit bağlantıları gerektiren Gelişmiş MS9,10 ya da Nükleer manyetik rezonans (NMR) teknikleri11belirlemek, özellikle zordur. Bu oligosakkaritler sentezi hızlı optimizasyonu böylece bu yavaş analitik adım işlem hacmi ile sınırlıdır.
Bu çalışmada, biz fucosylated trisaccharide tespiti bağlantı özgü göstermek laktoz tabanlı HMOs 2′-insan sütte en bol HMO olan fucosyllactose (2′-FL) odaklanan, genetik olarak kodlanmış kullanarak Escherichia coli tüm cep telefonu Biyoalgılayıcı bir sınırı olan 4 mg/l, algılama Bu Biyoalgılayıcı önemli bir özelliği isomeric trisaccharides arasında ayırt etmek için onun yetenek var. Tasarım prensibi varlığı hangi sırayla bir floresan sinyali üretir lac operon tarafından algılanır laktoz HMOs, üzerinden kurtarmak belirli fucosidases E. coli olarak ifade temel alır. Biz bunu bir bağlantı özgü fucosidase ve diğer bir floresan muhabir protein barındıran bir iki-plazmid sistemi kurarak başarmak. Bu Biyoalgılayıcı platform yüksek üretilen iş tarama Akış Sitometresi veya mikro-plaka okuyucu için uygundur. Biz de 2′-FL bir mühendislik zorlanma12tarafından üretilen miktarının içinde Biyoalgılayıcı kullanımını göstermektedir. Verilen bu mühendislik yapımcı zorlanma laktoz üzerinde yetiştirilen bu çalışma içinde biz da üç stratejileri Biyoalgılayıcı yanlış olumlu sinyal sonuçlanabilir laktoz seçici kaldırılması üzerinde mevcut.
Birlikte ele alındığında, genetik olarak kodlanmış biyosensörler algılamak ve HMOs bile zor bir bağlantı özgü şekilde ölçmek için bize izin Kromatografik, MS veya NMR teknikleri. Onun yüksek işlem hacmi ve kullanım kolaylığı nedeniyle, bu yöntem yaygın uygulamalar metabolik Mühendisliği ve HMOs sentezi olmalıdır.
Biz insan sütü oligosakkaritler yüksek üretilen iş stratejisi fucosylated bağlantı özgü tespiti için mevcut. Bu genetik olarak E. coli , indüksiyon belirli glukanlardir ile floresan bir sinyal ile yanıt mühendislik tarafından tüm cep telefonu biyosensörler yapı tarafından gerçekleştirilmiştir. İletişim kuralı da nasıl Biyoalgılayıcı algılamak ve metabolik olarak tasarlanmış bir bakteriyel yük HMOs ölçmek için kullanılabilir Tarih ayrıntıları.
Biz…
The authors have nothing to disclose.
Bu eser Iowa State Üniversitesi başlangıç fonlar tarafından desteklenmiştir. Fe kısmen NSF Trinect Bursu ve Manley Hoppe profesörlük tarafından finanse edildi. T.J.M. kısmen Karen ve Denny Vaughn öğretim bursu tarafından desteklenmiştir. Yazarlar Floresans ve LC-MS çalışmaları ile Iowa State Üniversitesi Akış Sitometresi tesis ve incelemelerinden Keck Metabolomics araştırma laboratuvarı yardım için teşekkür ederiz.
2’-Fucosyllactose | Carbosynth | 41263-94-9 | |
3-Fucosyllactose | Carbosynth | 41312-47-4 | |
Agar | Fisher Scientific | BP9744500 | |
Calcium Chloride, Dihydrate | Fisher Scientific | C79-500 | |
Carbenicillin | Fisher Scientific | BP26481 | |
Dextrose (D-Glucose), Anhydrous | Fisher Scientific | D16-1 | |
Flow Cytometer | BD | FACSCanto Plus RUO | |
HPLC | Agilent Technologies | 1100 Series HPLC system | |
HPLC Column | Luna | C18 reversed phase column | |
Kanamycin | Fisher Scientific | 11815024 | |
LB Broth, Miller | Fisher Scientific | 12-795-027 | |
Lactose | Fisher Scientific | 64044-51-5 | |
M9, Minimimal Salts, 5x | Sigma-Aldrich | M6030 | |
Magnesium Sulfate, Anhydrous | Fisher Scientific | M65-500 | |
MS | Agilent Technologies | Mass Selective Trap SL detector | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 7558-79-4 | |
Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 13472-35-0 |