Análisis de los trisacáridos de leche Fucosylated humanos en contexto biotecnológico mediante genéticamente codifican en biosensores
Özet
Describimos aquí el alto rendimiento detección y cuantificación de fucosylated oligosacáridos de leche humana (HMO) utilizando un biosensor de célula entera. También demostramos aquí, la adaptación de esta plataforma hacia análisis de cepas de producción de HMO, centrándose en mejorar la relación señal a ruido.
Abstract
Oligosacáridos de leche humana (HMO) son componentes de hidratos de carbono complejos de la leche materna humana que exhiben abundantes beneficios en la salud infantil. Sin embargo, optimización de su síntesis biotecnológica está limitada por el relativamente bajo rendimiento de detección y cuantificación de monosacárido y vínculos. Las técnicas convencionales de análisis de glicanos incluyen cromatografía/masa-spectrometric métodos con capacidad de producción del orden de cientos de muestras por día sin automatización. Aquí, demostramos un biosensor bacteriano genéticamente codificado para la detección de alto rendimiento, específicos de acoplamiento y cuantificación de las estructuras de fucosylated HMO, 2′-fucosyllactose y 3-fucosyllactose, que logramos mediante heteróloga expresión de fucosidases. Como la presencia de lactosa en leche o en procesos biotecnológicos podría llevar a falsos positivos, demostramos también la reducción de la señal de lactosa utilizando diferentes estrategias. Debido al alto rendimiento de esta técnica, podrían ensayarse muchas condiciones de la reacción o parámetros de biorreactor en paralelo en cuestión de horas, lo que permite la optimización de la fabricación de HMO.
Introduction
Oligosacáridos de leche humana (HMO) son oligosacáridos derivados de la lactosa, generalmente formado por monómeros de azúcar de tres a ocho. Tienen una reducción de la lactosa (Gal-β1, 4-Glc) final y son más alargadas por enlaces glicosídicos (β-1, 3 – o β-1, 6-) glucosa (Glc), galactosa (Gal) o N-acetilglucosamina (GlcNAc). Además, fucosa (Fuc, α-1, 2 – o α-1, 3-) o ácido siálico (Sia o NeuAc, 2,6 2,3 α o α-) residuos a menudo se añaden1.
Análisis actual de oligosacáridos y otros hidratos de carbono es limitado en alcance y rendimiento por la necesidad de cromatografía/masa espectrométrica (MS) tecnología2,3,4,5, 6 , 7, que puede tomar aproximadamente una hora por muestra, sin dejar de mencionar la necesidad de equipo costoso, columnas especializadas y agentes derivatizando y conocimientos sobre el funcionamiento de este equipo8. Vínculos de oligosacáridos son particularmente difíciles de determinar, requiriendo avanzado MS9,10 o técnicas de resonancia magnética nuclear (RMN)11. Optimización rápida de la síntesis de estos oligosacáridos está así limitada por el rendimiento de este lento paso analítico.
En este estudio, demostramos la detección de acoplamiento específicos de trisacárido fucosylated HMO basada en lactosa, centrándose en 2′-fucosyllactose (2′-FL) que es la HMO más abundante en la leche humana, usando un codificado genéticamente células enteras de Escherichia coli biosensor con un límite de detección en 4 mg/L. Una característica importante de este biosensor es su capacidad para distinguir entre trisacáridos isoméricos. El principio de diseño se basa en la expresión de la específica fucosidases en e. coli que liberar lactosa de HMO, la presencia de la cual es detectada por el operón lac , que a su vez genera una señal fluorescente. Logramos esto mediante la construcción de un sistema de dos plásmidos, uno que el fucosidase específicos de acoplamiento y el otro una proteína fluorescente reportera. Esta plataforma de biosensores es adecuada para el cribado de alto rendimiento por citometría de flujo o lector de micro placas. Nos demuestran también la utilización del biosensor en la cuantificación de 2′-FL producida por una cepa ingeniería12. Dentro de este estudio, también presentamos tres estrategias de eliminación selectiva de lactosa que puede dar lugar a falsa señal positiva de los biosensores, dado que se cultiva la cepa productora Ingeniería en lactosa.
Tomados en conjunto, los biosensores genéticamente codificados permiten detectar y cuantificar las HMO de una manera específica de acoplamiento, que es difícil incluso con cromatografía, MS y NMR técnicas. Debido a su alto rendimiento y facilidad de uso, este método debe tener aplicaciones generalizadas en la ingeniería metabólica y la síntesis de las HMO.
Protocol
Representative Results
Discussion
Presentamos una estrategia de alto rendimiento para la detección de acoplamiento específicos de fucosylated oligosacáridos de leche humana. Esto se logró mediante la construcción de biosensores de célula entera por ingeniería genética de e. coli que en inducción con glycans específicas responden con una señal fluorescente. El protocolo también detalles sobre cómo se puede utilizar el biosensor para detectar y cuantificar las HMO en una cepa bacteriana metabólicamente ingeniería.
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por el estado de Iowa Universidad Inicio fondos. F.E. fue parcialmente financiado por la NSF Trinect compañerismo y Manley Hoppe Cátedra. T.J.M. fue apoyada parcialmente por la Karen y Denny Vaughn Facultad beca. Los autores agradecen a la instalación de citometría de flujo de Iowa estado Universidad y el laboratorio de investigación de Metabolómica de W.M. Keck para la asistencia con fluorescencia y LC-MS estudios.
Materials
| 2’-Fucosyllactose | Carbosynth | 41263-94-9 | |
| 3-Fucosyllactose | Carbosynth | 41312-47-4 | |
| Agar | Fisher Scientific | BP9744500 | |
| Calcium Chloride, Dihydrate | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Carbenicillin | Fisher Scientific | BP26481 | |
| Dextrose (D-Glucose), Anhydrous | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Flow Cytometer | BD | FACSCanto Plus RUO | |
| HPLC | Agilent Technologies | 1100 Series HPLC system | |
| HPLC Column | Luna | C18 reversed phase column | |
| Kanamycin | Fisher Scientific | 11815024 | |
| LB Broth, Miller | Fisher Scientific | 12-795-027 | |
| Lactose | Fisher Scientific | 64044-51-5 | |
| M9, Minimimal Salts, 5x | Sigma-Aldrich | M6030 | |
| Magnesium Sulfate, Anhydrous | Fisher Scientific | M65-500 | |
| MS | Agilent Technologies | Mass Selective Trap SL detector | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 7558-79-4 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 13472-35-0 |
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