ניתוח של האדם Fucosylated Trisaccharides חלב בהקשר ביוטכנולוגי באמצעות גנטית מקודד ביולוגיים
Özet
נתאר כאן את כימות של fucosylated חלב oligosaccharides (קופות החולים) באמצעות ביוסנסור תאים שלמים וזיהוי תפוקה גבוהה. גם נדגים כאן, את העיבוד של פלטפורמה זו לקראת ניתוח זנים לייצור קופות החולים, תוך התמקדות בשיפור את האות לרעש יחס.
Abstract
Oligosaccharides בחלב (קופות החולים) הם פחמימות מורכבות מרכיבים של חלב אם אנושי כי התערוכה בשפע הטבות על בריאות התינוק. עם זאת, אופטימיזציה של סינתזה ביוטכנולוגי שלהם מוגבל על ידי את התפוקה נמוכה יחסית של זיהוי, כימות של חד-סוכר למוטות וחיבורים. טכניקות שגרתיות של ניתוח glycan כוללות שיטות כרומטוגרפי/מסה-spectrometric עם תפוקה של הסדר מאות דוגמאות ליום ללא אוטומציה. נדגים כאן, של ביוסנסור חיידקי מקודדים גנטית תפוקה גבוהה, הצמדה ספציפי זיהוי, כימות של מבנים fucosylated קופות החולים, 2′-fucosyllactose 3-fucosyllactose, אשר השגנו ויה heterologous ביטוי של fucosidases. משום הנוכחות של לקטוז בחלב או בתהליכים הביו-טכנולוגיה עלול לגרום תוצאות חיוביות שגויות, אנחנו גם להוכיח ההפחתה של האות מ לקטוז באמצעות אסטרטגיות שונות. בשל התפוקה הגבוהה של טכניקה זו, תנאי ריאקציה או ביוריאקטור פרמטרים רבים יכול להיות לבדיקה במקביל תוך מספר שעות, המאפשרות אופטימיזציה של קופות החולים הייצור.
Introduction
Oligosaccharides בחלב (קופות החולים) הם לקטוז, נגזר oligosaccharides, הכוללת בדרך כלל 3 עד 8 סוכר מונומרים. הם יש לקטוז (גל-β1, 4-Glc) הפחתת בסוף, הם עוד יותר מאורך על-ידי קישורים glycosidic (β-1, 3 – או β-1, 6-) (Glc) גלוקוז, גלקטוז (Gal) או N-acetylglucosamine (GlcNAc). בנוסף, fucose (Fuc, α-1, 2 – או α-1, 3-) או חומצה sialic (Sia או NeuAc, α-2, 3 – או α-2, 6-) שאריות לעיתים קרובות נוספות1.
הניתוח הנוכחי של oligosaccharides ופחמימות אחרות מוגבל התפוקה ואת היקף על ידי הצורך כרומטוגרפי/מסה spectrometric (MS) טכנולוגיה2,3,4,5, 6 , 7, אשר יכול לקחת בערך שעה עבור דגימה, שלא לדבר על הצורך של ציוד יקר, עמודות מיוחדים סוכנים derivatizing, ואת המומחיות על המבצע של ציוד זה8. פחמימה # מיון הפחמימות קישורים קשים במיוחד לקבוע, הדורשים MS מתקדם9,10 או טכניקות תהודה מגנטית גרעינית (NMR)11. אופטימיזציה מהירה של סינתזה של אלה oligosaccharides ובכך מוגבל על ידי התפוקה של שלב זה אנליטי איטי.
במחקר זה, נדגים זיהוי ספציפי הצמדה של fucosylated trisaccharide קופות מבוססות-לקטוז, התמקדות 2′-fucosyllactose (2′-פל) הנמצא שקמתי הנפוץ ביותר בחלב, באמצעות מקודדים גנטית Escherichia coli כל התא ביוסנסור עם מגבלה של זיהוי-4 מ ג/ל’ תכונה חשובה של ביוסנסור זו, היא יכולתה להבחין בין isomeric trisaccharides. עקרון העיצוב מבוסס על הביטוי של fucosidases ספציפי ב e. coli זה לשחרר לקטוז של קופות חולים, הנוכחות של אשר הוא זוהה על ידי הלקטוז, אשר בתורו מפיק אות ניאון . נוכל להשיג זאת על ידי בניית מערכת דו-פלסמיד, אחד מסתיר את fucosidase ספציפיים הצמדה והשני חלבון כתב פלורסנט. הפלטפורמה ביוסנסור מתאימה להקרנה תפוקה גבוהה על-ידי cytometry זרימה או מיקרו-plate הקורא. אנחנו גם להוכיח את הניצול של החיישן ב לכימות 2′-FL המיוצר על ידי זן מהונדסים12. במסגרת מחקר זה, אנו מציגים גם שלוש אסטרטגיות על הסרה סלקטיבית של לקטוז שיכול לגרום אות חיובי כוזב החיישן, בהתחשב בכך המתח מפיק מהונדסים התרגלתי לקטוז.
יחדיו ביולוגיים מקודדים גנטית מאפשרים לנו לזהות ולכמת קופות החולים באופן ספציפי הצמדה, אשר קשה אפילו עם כרומטוגרפי, MS, או NMR טכניקות. בשל תפוקה גבוהה שלה קלות שימוש, שיטה זו צריך יישומים נפוצים הנדסה מטבולית, סינתזה של קופות החולים.
Protocol
Representative Results
Discussion
אנו מציגים אסטרטגיה תפוקה גבוהה לאיתור ספציפי הצמדה fucosylated בחלב oligosaccharides. דבר זה הושג על ידי בניית התא כולו ביולוגיים באמצעות הנדסה גנטית e. coli אשר על אינדוקציה עם glycans מסוימים מגיבים אות ניאון. הפרוטוקול מפרט גם על איך החיישן יכול לשמש כדי לזהות ולכמת קופות החולים בזן חיידקי סמויה מהו?…
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי איווה המדינה אוניברסיטת הפעלה כספים. הקיבולות נשמר מומן בחלקו על ידי ה-NSF Trinect אחוות מנלי Hoppe פרופסורה. T.J.M. מומן בחלקו על ידי קרן דני מלגת הפקולטה ווהן. המחברים תודה איווה המדינה אוניברסיטת Flow Cytometry המתקן את מעבדת המחקר גליקומיקס קק W.M. לקבלת סיוע עם פלורסצנטיות ולימודי LC-MS.
Materials
| 2’-Fucosyllactose | Carbosynth | 41263-94-9 | |
| 3-Fucosyllactose | Carbosynth | 41312-47-4 | |
| Agar | Fisher Scientific | BP9744500 | |
| Calcium Chloride, Dihydrate | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Carbenicillin | Fisher Scientific | BP26481 | |
| Dextrose (D-Glucose), Anhydrous | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Flow Cytometer | BD | FACSCanto Plus RUO | |
| HPLC | Agilent Technologies | 1100 Series HPLC system | |
| HPLC Column | Luna | C18 reversed phase column | |
| Kanamycin | Fisher Scientific | 11815024 | |
| LB Broth, Miller | Fisher Scientific | 12-795-027 | |
| Lactose | Fisher Scientific | 64044-51-5 | |
| M9, Minimimal Salts, 5x | Sigma-Aldrich | M6030 | |
| Magnesium Sulfate, Anhydrous | Fisher Scientific | M65-500 | |
| MS | Agilent Technologies | Mass Selective Trap SL detector | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 7558-79-4 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 13472-35-0 |
Referanslar
- Ninonuevo, M. R., et al. A strategy for annotating the human milk glycome. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54 (20), 7471-7480 (2006).
- Kailemia, M. J., Ruhaak, L. R., Lebrilla, C. B., Amster, I. J. Oligosaccharide analysis by mass spectrometry: a review of recent developments. Analytical Chemistry. 86 (1), 196-212 (2014).
- Royle, L. Chapter 8 – Glycans and Monosaccharides. Liquid Chromatography. , 185-202 (2013).
- Shubhakar, A., Reiding, K. R., Gardner, R. A., Spencer, D. I. R., Fernandes, D. L., Wuhrer, M. High-Throughput Analysis and Automation for Glycomics Studies. Chromatographia. 78 (5-6), 321-333 (2015).
- Goubet, F., Jackson, P., Deery, M. J., Dupree, P. Polysaccharide analysis using carbohydrate gel electrophoresis: a method to study plant cell wall polysaccharides and polysaccharide hydrolases. Analytical Biochemistry. 300 (1), 53-68 (2002).
- Evangelista, R. A., Liu, M. -. S., Chen, F. -. T. A. Characterization of 9-Aminopyrene-1,4,6-trisulfonate Derivatized Sugars by Capillary Electrophoresis with Laser-Induced Fluorescence Detection. Analytical Chemistry. 67 (13), 2239-2245 (1995).
- Jiao, J., Zhang, H., Reinhold, V. N. High Performance IT-MS Sequencing of Glycans (Spatial Resolution of Ovalbumin Isomers). International Journal of Mass Spectrometry. 303 (2-3), 109-117 (2011).
- Doherty, M., et al. An automated robotic platform for rapid profiling oligosaccharide analysis of monoclonal antibodies directly from cell culture. Analytical Biochemistry. 442 (1), 10-18 (2013).
- Hsu, H. C., Liew, C. Y., Huang, S. -. P., Tsai, S. -. T., Ni, C. -. K. Simple Method for De Novo Structural Determination of Underivatised Glucose Oligosaccharides. Scientific Reports. 8 (1), 5562 (2018).
- Mank, M., Welsch, P., Heck, A. J. R., Stahl, B. Label-free targeted LC-ESI-MS2 analysis of human milk oligosaccharides (HMOs) and related human milk groups with enhanced structural selectivity. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (1), 231-250 (2019).
- Chai, W., Piskarev, V. E., Zhang, Y., Lawson, A. M., Kogelberg, H. Structural determination of novel lacto-N-decaose and its monofucosylated analogue from human milk by electrospray tandem mass spectrometry and 1H NMR spectroscopy. Archives of Biochemistry and Biophysics. 434 (1), 116-127 (2005).
- Baumgärtner, F., Seitz, L., Sprenger, G. A., Albermann, C. Construction of Escherichia coli strains with chromosomally integrated expression cassettes for the synthesis of 2’-fucosyllactose. Microbial Cell Factories. 12 (1), 1-13 (2013).
- Matsuki, T., et al. A key genetic factor for fucosyllactose utilization affects infant gut microbiota development. Nature Communications. 7, 11939 (2016).
- Enam, F., Mansell, T. J. Linkage-Specific Detection and Metabolism of Human Milk Oligosaccharides in Escherichia coli. Cell Chemical Biology. 25 (10), 1292-1303 (2018).
