Enteroids מתגלים כמודל הרומן במחקר של מחלות אנושיות. הפרוטוקול מתאר כיצד לדמות מודל enteroid של האדם enterocolitis נפאסיאטיס באמצעות טיפול ליפופוליסכריד (LPS) enteroids שנוצר מרקמות neonatal. Enteroids שנאספו להדגים שינויים דלקתיים דומה לאלה לראות enterocolitis נפאסיאטיס אנושי.
דלקת מעי נמקית (NEC) היא מחלה הרסנית של יילוד תינוקות. זה מאופיין על ידי מספר שינויים pathophysiologic האפיתל מעיים אנושיים, המוביל אל הגברת חדירות המעי, ליקויי פיצוי, והגדילה מוות של תאים. למרות שיש רבים מודלים חייתיים של NEC, ייתכן בתגובה לפציעה והתערבויות טיפוליות משתנה מאוד בין המינים. יתר על כן, זה מאתגר מבחינה אתית ללמוד פתופסיולוגיה המחלה או הרומן סוכני טיפולית ישירות בנושאים אנושיים, במיוחד לילדים. לכן רצוי מאוד לפתח מודל הרומן של NEC באמצעות רקמה אנושית. Enteroids הם organoids תלת-ממדי שמקורם בתאי אפיתל המעי. הם אידיאליים עבור חקר אינטראקציות מורכבות הפיזיולוגיות, איתות התא ואת ההגנה פתוגן-פונדקאי. כתב יד זה נתאר פרוטוקול enteroids האנושי הזה תרבויות לאחר בידוד תאי גזע מעיים של חולים שעברו כריתה מעי. התאים קריפטה מתורבתים בתקשורת המכיל חומרים המעודדים בידול לתוך הילידים סוגי תאים שונים של האפיתל במעי האדם. תאים אלה גדלים תערובת סינתטית, סילוק של חלבונים לשמש לפיגום, מחקה קרום המרתף הסלולר במיוחד. כתוצאה מכך, enteroids לפתח קוטביות הפסגה-basolateral. ניהול משותף של ליפופוליסכריד (LPS) בתקשורת גורם לתגובה דלקתית enteroids, המוביל היסטולוגית, גנטית, וכן שינויים בביטוי חלבונים דומים לאלה לראות ב- NEC אנושי. מודל ניסיוני של NEC באמצעות רקמה אנושית עשוי לספק פלטפורמה יותר מדויק עבור תרופות וטיפול בדיקות לפני בניסויים בבני אדם, כאשר אנו שואפים לזהות תרופה למחלה זו.
Enteroids האנושי הם אקסית vivo מערכת תרבות תלת-ממדי שנוצר מתאי גזע מבודד כוכים מעיים של דגימות רקמה אנושית מעיים. מודל זה פורצת היה חלוץ מאת הנס Clevers et al. בשנת 2007, בעקבות הגילוי של Lgr5 + תאי גזע-כוכים של המעי הדק עכברים1. העבודה שלהם הונחו היסודות להקמת אקסית vivo תרבות אפיתל המעי סוגי תאים מרובים, זה יכול להיות passaged ללא שינויים משמעותיים גנטית או הפיזיולוגיות2. מאז התגלית, enteroids שימשו כמודל הרומן ללמוד פיזיולוגיה עיכול נורמלי, הפתופיזיולוגיה של מחלות מעיים כגון מחלות מעי דלקתיות, אינטראקציות פתוגן-פונדקאי רפואה רגנרטיבית2.
השימוש של enteroids בתור אקסית vivo מודל לחקר פתופסיולוגיה מעיים יש כמה יתרונות על פני שיטות אלטרנטיביות. מספר עשורים, היו בשימוש בבעלי חיים וקווים מונצחים תא נגזר סרטן המעי ללמוד פיזיולוגיה מעיים3,4,5. תרבויות תא בודד אינם מייצגים את הגיוון של סוגי תאים נוכח נורמלי אפיתל המעי, ובכך חסר לתא צולבות לדבר וספציפיות קטע-ביטוי חלבון, איתות, מחלה הנגרמת הפתוגן6. בתאי גזע enteroids להתמיין סרן סוגי תאים אפיתל כגון enterocytes, Paneth תאים, תאי גביע, תאים enteroendocrine עוד3. הם מפגינים קוטביות, לבצע פונקציות תחבורה אפיתל, וגם מאפשרים קטע המעי ירידה לפרטים6. מאז enteroids ניתן לסכם מספר סוגי תא אפיתל המעי האנושי, הם מסוגלים להתגבר על מגבלה זו מוכרת של מערכות מבוססות תאי סרטן. לאורך זמן, נגזרות של שורות תאים הם subcloned ולהתפתח שהפגינו גיוון רב יותר חלבון בלוקליזציה וביטוי3. להיפך, enteroids יכול להיות passaged ללא שינויים משמעותיים גנטית או הפיזיולוגיות2. אמנם קיימים מודלים רבים של NEC, ייתכן בתגובה לפציעה והתערבויות טיפוליות משתנה מאוד בין המינים. בשל מגבלות אלו, שמקורם בבעלי חיים הרפוי להיכשל 90% מהזמן כאשר נבדק בניסויים האנושי בגלל ההבדלים רעילות או יעילות3. Enteroids לשמש מודלים קליניים מבטיח כי ניתן להתגבר על ליקויים אלה, המוביל אל הבנה טובה יותר של מורכבות פתופסיולוגיה מעיים, לכן, ועוד חידושים טיפולית מוצלחת וחסכונית. יש גם ראיות האחרונות הגיל של רקמת כי enteroid מופק נשאר חשוב מבחינה ביולוגית7. זהו פרט חשוב במיוחד עבור המודל שלנו מאז enteroids נוצרות מרקמות neonatal, ובכך שומר על רלוונטיות הפיזיולוגיות לחולים עם NEC.
השירות של enteroids בתור מודלים של מחלות אנושיות ממשיכה להתרחב, בתקווה למצוא מרפא לתנאים חמורה ו נרחבת. דלקת מעי נמקית (NEC) היא מחלה הרסנית מעיים של neonates מאופיין נמק המעי וגורם לעתים קרובות לחירור של המעי קיר, הרעלת דם, מוות8. בשל פתופיזיולוגיה multifactorial ומורכבת של NEC, המכניזם המדויק של המחלה יש לא עדיין היה מלא מבואר; עם זאת, הגברת חדירות המעי היה בבירור מעורב תהליך המחלה8. נתון כי המחקר של NEC וסוכנים טיפולית פוטנציאל הוא מאתגר מבחינה אתית של ניסויים, במיוחד לילדים, רצוי מאוד לנצל את מודל enteroid רלוונטי מבחינה ביולוגית של NEC באמצעות רקמה אנושית neonatal. עד כה, enteroids יש תפקיד מוגבל במחקר של NEC. פרוטוקול זה מתאר את השימוש enteroids נגזר דגימות רקמה אנושית מעיים כמו רומן ex-vivo מודל לחקר נמקית.
רומן זה ex-vivo enteroid מעיים אנושיים המודל משמש שיטה שימושית לצורך המחקר של תפקוד מכשול מעי נמקית (NEC). שיטות עיבוד enteroid המובאת כאן הוסבו מעבודה קודמת של ד”ר מיסטי טוב, מייקל Helmrath, ג’ייסון ורטהיים10,11,12.
הפרטים סביב כל אוסף רקמה והתז?…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי המכון של המוסד לביטוח לאומי של סוכרת, העיכול, גרנט מחלת הכליה (K08DK106450) ופרס ג’יי Grosfeld של האגודה האמריקאית כירורגי בילדים כדי C.J.H.
4% Paraformaldehyde | ThermoFisher | AAJ19943K2 | |
A-83 | R&D Tocris | 2939/10 | |
Amphotericin B | ThermoFisher | 15290026 | |
B-27 supplement minus Vitamin A | ThermoFisher | 17504-044 | |
Basement Membrane Matrix (Matrigel) | Corning | CB-40230C | |
DMEM/F-12 | ThermoFisher | MT-16-405-CV | |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher | 11-965-118 | |
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | ThermoFisher | 14190-144 | |
Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma | E9644-.2MG | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | EDS-500G | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini Bio-Pro | 100-125 | |
Gentamicin | Sigma | G5013-1G | |
GlutaMAX (L-glutamine) | ThermoFisher | 35050-061 | |
Insulin | Sigma | I9278-5mL | |
[leu] 15-gastrin 1 | Sigma | G9145-.1MG | |
Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma | L2630-25MG | |
N-2 supplement | ThermoFisher | 17502-048 | |
N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) | ThermoFisher | 15630-080 | |
N-Acetylcysteine | Sigma | A9165-5G | |
Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | |
Noggin | R&D Systems INC | 6057-NG/CF | |
Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140-148 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | P5368-5X10PAK | |
RPMI 1640 Medium | Invitrogen | 11875093 | |
R-Spondin | PEPROTECH INC | 120-38 | |
SB202190 | Sigma | S7067-5MG | |
Tissue Processing Gel (Histogel) | ThermoFisher | 22-110-678 | |
Wnt3a | R&D Systems INC | 5036-WN-010 | |
Y-27632 | Sigma | Y0503-1MG |