Indução de Hepatite Autoimune Induzida por Drogas em CAMUNDONGOS BALB/c para o Estudo de Seus Mecanismos Patogênicos

O objetivo deste método é descrever um modelo de camundongo de hepatite autoimune induzida por drogas que se desenvolve in vivo e demonstrar como ela pode ser utilizada para investigar a base molecular, imunológica e genética desta doença. O objetivo de longo prazo de nossos estudos é descobrir mecanismos responsáveis pelo desenvolvimento de inflamação hepática crônica e lesão, estudando DIH em pacientes suscetíveis. A doença hepática e a cirrose constituem a sexta causa de morte mais comum em adultos entre 25 e 64 anos. DILI idiossincrática, às vezes referida como hepatite autoimune induzida por drogas (DIH) é a terceira causa mais comum de insuficiência hepática aguda nos Estados Unidos. DIH é o processo de hipersensibilidade hepática mais comum, observado em aproximadamente 9 a 12% dos pacientes com hepatite^{autoimune 1}. A maioria esmagadora dos pacientes com DIH são mulheres ^2,3,4. Um tipo de DIH desenvolve-se em indivíduos suscetíveis após a administração de anestésicos voláteis halogenados, como isoflurano, sevoflurano, desflurano ou halotano. Esses anestésicos se ligam covalentemente a proteínas hepáticas com produtos reativos de seu metabolismo, criando assim novos autoantigens capazes de provocar respostas alérgicas ou autoimunes⁵.

O estudo de mecanismos patogênicos envolvidos no desenvolvimento de anestésicos e qualquer forma de DIH tem sido previamente dificultado pela falta de um modelo animal que imita de perto a indução da doença humana. Desenvolvemos um modelo experimental de murina de DIH com características semelhantes à DILI mediada imunológica em pacientes. A hepatite é induzida pela imunização com um dos dois autoantígenos que foram covalentemente modificados pelo metabólito de cloreto de trifluoroacetil (TFA) que é formado seguindo o metabolismo oxidativo do anestésico pelo citocromo enzimático P450 2E1 (CYP2E1)⁵. Um autoantígeno é a fração hepática cística cística hepótica S100, que é uma mistura de várias proteínas⁶, e o segundo autoantígeno é um epítope de CYP2E1 que é reconhecido por soro de pacientes com DILI⁷ anestésico imuno mediado. Ao usar camundongos BALB/c, que são relativamente resistentes à hepatite autoimune experimental, distinguemos nosso modelo do modelo de imunização induzido pelo S100 de hepatite autoimune em camundongos C57Bl/6J⁸.

Devido às suas diversas apresentações clínicas, o DIH é difícil de estudar em pacientes. Modelos experimentais translacionais oferecem a capacidade de avaliar a patogênese da doença in vivo e in vitro. Atualmente, não existem outros métodos alternativos para induzir DIH que examinem totalmente as respostas imunes in vivo ou in vitro adaptativas ou inatas sem o uso de animais. Além disso, como a trifluoroacetilação do S-100 ou do epítope CYP2E1 não parece produzir um imunogênio irritante, e estamos induzindo o DIH pela imunização com proteínas alteradas pelo TFA, esses animais não receberão éter, qualquer anestésico halogenado, barbiturado ou álcool antes da imunização ou outros procedimentos, considerando que esses agentes podem alterar os parâmetros que estamos estudando. Mesmo assim, diminuímos o uso do nosso mouse utilizando simulação de computador para confirmar as preferências vinculantes do nosso epítope CYP2E1^{descoberto 9} e espelhamos o DIH humano implicando sexo feminino, demonstrando que ratos BALB/c fêmeas desenvolvem um DIH¹⁰ mais severo.

Apesar das diversas apresentações de DIH em pacientes e desafios no estudo da doença clínica, a modificação pós-translacional de proteínas nativas por metabólitos reativas é um mecanismo-chave aceito na patogênese DIH que segue anestésicos halogenados¹¹. Os investigadores também aceitam que o CYP2E1 é um grande autoantígeno neste processo^12,13. O papel das células CD4+T regulamentadas (IL)-4-upregulated que reconhecem um CYP2E1 pós-translacionada e outras proteínas hepáticas é um iniciador aceito de DIH anestésico, atraindo neutrófilos, eosinófilos e células de mastro para o fígado¹⁴, e este mecanismo foi confirmado em muitas formas de DIH^15,16. As células CD4+CD25+T (Tregs) induzidas a expressar o FoxP3 reduzem a gravidade do DIH, e deficiências relativas dessas células no baço pioram o DIH ^10,7. Assim, a maioria dos avanços na compreensão do DIH têm sido possíveis utilizando modelos de camundongos in vivo para avaliar os mecanismos genéticos, metabólicos e imunológicos do DIH tanto in vivo quanto in vitro.

Como nós e outros investigadores descobrimos papéis para IL-4, neutrófilos e eosinófilos no início do DIH usando diferentes modelos de camundongos, acreditamos que esta observação suporta nossa alegação de que, independentemente do modelo DIH utilizado, hepatite e lesão são induzidas pelo IL-4. A força do nosso protocolo está na utilização da metodologia in vivo, tanto de camundongos masculinos quanto femininos, e na repetição da histologia, ensaios de proliferação de células T CD4+ e citocinas. A força do nosso uso de estudos in vitro é que eles reduzem o número de camundongos necessários, fornecendo a metodologia para isolar as interações celulares que impulsionam o DIH. Recomendamos o uso de camundongos masculinos e femininos, pois isso reduz a possibilidade de viés inconsciente na interpretação dos resultados e fortalece o potencial de tradução de nossos estudos, uma vez que a incidência, prevalência e gravidade do DIH é maior em mulheres^{de 17 anos}. Recomendamos que os camundongos sejam obtidos de um único fornecedor; no entanto, se isso não for possível, obtenha controles de erva-mate ou camundongos do mesmo tipo de fornecedor que os camundongos geneticamente alterados.