Induktion der medikamenteninduzierten Autoimmunhepatitis bei BALB/c-Mäusen zur Untersuchung ihrer pathogenen Mechanismen

Der Zweck dieser Methode ist es, ein Mausmodell der medikamenteninduzierten Autoimmunhepatitis zu beschreiben, das sich in vivo entwickelt, und zu zeigen, wie es verwendet werden kann, um die molekularen, immunologischen und genetischen Grundlagen dieser Krankheit zu untersuchen. Das langfristige Ziel unserer Studien ist es, Mechanismen aufzudecken, die für die Entstehung chronischer Leberentzündungen und -verletzungen verantwortlich sind, indem wir DIH bei anfälligen Patienten untersuchen. Lebererkrankungen und Zirrhose stellen die sechsthäufigste Todesursache bei Erwachsenen zwischen 25 und 64 Jahren dar. Idiosynkratische DILI, manchmal auch als medikamenteninduzierte Autoimmunhepatitis (DIH) bezeichnet, ist die dritthäufigste Ursache für akutes Leberversagen in den Vereinigten Staaten. DIH ist der häufigste hepatische medikamenteninduzierte Hypersensibilisierungsprozess, der bei etwa 9 bis 12% der Patienten mit Autoimmunhepatitis¹ beobachtet wurde. Die überwiegende Mehrheit der Patienten mit DIH sind Frauen ^2,3,4. Eine Art von DIH entwickelt sich bei anfälligen Personen nach Verabreichung von halogenierten flüchtigen Anästhetika wie Isofluran, Sevofluran, Desfluran oder Halothan. Diese Anästhetika binden kovalent an Leberproteine mit reaktiven Produkten ihres Stoffwechsels und erzeugen so neuartige Autoantigene, die allergische oder Autoimmunreaktionen hervorrufen^{können 5}.

Die Untersuchung pathogener Mechanismen, die an der Entwicklung von Anästhetika und jeder Form von DIH beteiligt sind, wurde zuvor durch das Fehlen eines Tiermodells behindert, das die Induktion menschlicher Krankheiten genau nachahmt. Wir haben ein experimentelles murines Modell von DIH mit Merkmalen entwickelt, die immunvermitteltem DILI bei Patienten ähneln. Hepatitis wird durch Immunisierung mit einem von zwei Autoantigenen induziert, die kovalent durch den Trifluoracetylchlorid (TFA)-Metaboliten modifiziert wurden, der nach oxidativem Metabolismus des Anästhetikums durch das Enzym Cytochrom P450 2E1 (CYP2E1)⁵ gebildet wird. Ein Autoantigen ist die hepatische zytosolische S100-Leberfraktion, die eine Mischung aus mehreren Proteinen⁶ ist, und das zweite Autoantigen ist ein Epitop von CYP2E1, das von Seren bei Patienten mit immunvermitteltem Anästhesie-DILI⁷ erkannt wird. Durch die Verwendung von BALB/c-Mäusen, die relativ resistent gegen experimentelle Autoimmunhepatitis sind, unterscheiden wir unser Modell vom S100-induzierten Immunisierungsmodell der Autoimmunhepatitis bei C57Bl/6J-Mäusen⁸.

Aufgrund seiner vielfältigen klinischen Präsentationen ist das DIH bei Patienten schwer zu untersuchen. Translationale experimentelle Modelle bieten die Möglichkeit, die Pathogenese der Krankheit in vivo und in vitro zu bewerten. Derzeit gibt es keine anderen alternativen Methoden zur Induktion von DIH, die in vivo oder in vitro adaptive oder angeborene Immunantworten ohne den Einsatz von Tieren vollständig untersuchen. Da die Trifluoracetylierung von S-100 oder dem CYP2E1-Epitop kein irritierendes Immunogen zu produzieren scheint und wir DIH durch Immunisierung mit TFA-veränderten Proteinen induzieren, erhalten diese Tiere vor der Immunisierung oder anderen Verfahren keinen Ether, halogenierte Anästhetika, Barbiturat oder Alkohol, da diese Mittel die von uns untersuchten Parameter verändern können. Trotzdem haben wir unseren Mausverbrauch reduziert, indem wir Computersimulationen verwendet haben, um die Bindungspräferenzen unseres entdeckten CYP2E1-Epitops 9 zu bestätigen, und haben menschliches DIH gespiegelt, das weibliches Geschlecht impliziert, indem wir gezeigt haben^, dass weibliche BALB / c-Mäuse einen schwereren DIH¹⁰ entwickeln.

Trotz vielfältiger Darstellungen von DIH bei Patienten und Herausforderungen bei der Erforschung klinischer Erkrankungen ist die posttranslationale Modifikation nativer Proteine durch reaktive Wirkstoffmetaboliten ein anerkannter Schlüsselmechanismus in der Pathogenese DIH, die auf halogenierte Anästhetika folgt¹¹. Die Forscher akzeptieren auch, dass CYP2E1 ein wichtiges Autoantigen in diesem Prozess^{ist 12,13}. Die Rolle von Interleukin (IL)-4-upregulierten CD4+T-Zellen, die ein posttranslational modifiziertes CYP2E1 und andere Leberproteine erkennen, ist ein akzeptierter Initiator von anästhetischem DIH, indem sie Neutrophile, Eosinophile und Mastzellen in die Leber 14 lockt, und dieser Mechanismus wurde in vielen Formen von DIH ^15,16 bestätigt. Induzierte FoxP3-exprimierende CD4+CD25+T-Zellen (Tregs) reduzieren den Schweregrad von DIH, und relative Mängel dieser Zellen in der Milz verschlimmern DIH ^10,7. So wurden die meisten Fortschritte beim Verständnis von DIH durch die Verwendung von In-vivo-Mausmodellen ermöglicht, um die genetischen, metabolischen und immunologischen Mechanismen von DIH sowohl in vivo als auch in vitro zu bewerten.

Da wir und andere Forscher Rollen für IL-4, Neutrophile und Eosinophile bei der Initiierung von DIH mit verschiedenen Mausmodellen aufgedeckt haben, glauben wir, dass diese Beobachtung unsere Behauptung stützt, dass unabhängig vom verwendeten DIH-Modell Hepatitis und Verletzung durch IL-4 induziert werden. Die Stärke unseres Protokolls liegt in der Anwendung der In-vivo-Methodik, sowohl männlicher als auch weiblicher Mäuse, und der Wiederholung von Histologie, CD4+ T-Zell-Proliferationsassays und Zytokinen. Die Stärke unserer Verwendung von In-vitro-Studien besteht darin, dass sie die Anzahl der benötigten Mäuse reduzieren und gleichzeitig die Methodik zur Isolierung zellulärer Interaktionen bereitstellen, die DIH antreiben. Wir empfehlen die Verwendung von männlichen und weiblichen Mäusen, da dies die Möglichkeit einer unbewussten Verzerrung bei der Interpretation der Ergebnisse verringert und das Übersetzungspotenzial unserer Studien stärkt, da die Inzidenz, Prävalenz und Schwere von DIH bei Frauen^{17 höher} ist. Wir empfehlen, dass Mäuse von einem einzigen Anbieter bezogen werden; Wenn dies jedoch nicht möglich ist, besorgen Sie sich Wurfpartnerkontrollen oder Wildtyp-Mäuse vom selben Anbieter wie die genetisch veränderten Mäuse.