Inductie van geneesmiddel-geïnduceerde, auto-immune hepatitis bij BALB / c-muizen voor de studie van de pathogene mechanismen

Het doel van deze methode is om een muismodel van door geneesmiddelen geïnduceerde auto-immune hepatitis te beschrijven dat zich in vivo ontwikkelt en aan te tonen hoe het kan worden gebruikt om de moleculaire, immunologische en genetische basis van deze ziekte te onderzoeken. Het langetermijndoel van onze studies is om mechanismen te ontdekken die verantwoordelijk zijn voor de ontwikkeling van chronische leverontsteking en -letsel door DIH bij gevoelige patiënten te bestuderen. Leverziekte en cirrose vormen de zesde meest voorkomende doodsoorzaak bij volwassenen tussen de 25 en 64 jaar. Idiosyncratische DILI, soms aangeduid als geneesmiddel-geïnduceerde auto-immune hepatitis (DIH) is de derde meest voorkomende oorzaak van acuut leverfalen in de Verenigde Staten. DIH is het meest voorkomende door levergeneesmiddelen geïnduceerde overgevoeligheidsproces dat wordt waargenomen bij ongeveer 9 tot 12% van de patiënten met auto-immune hepatitis¹. De overgrote meerderheid van de patiënten met DIH zijn vrouwen ^2,3,4. Een type DIH ontwikkelt zich bij gevoelige personen na toediening van gehalogeneerde vluchtige anesthetica zoals isofluraan, sevofluraan, desfluraan of halothaan. Deze anesthetica binden covalent aan levereiwitten met reactieve producten van hun metabolisme, waardoor nieuwe autoantigenen worden gecreëerd die allergische of auto-immuunreacties kunnen veroorzaken⁵.

De studie van pathogene mechanismen die betrokken zijn bij de ontwikkeling van anestheticum en elke vorm van DIH is eerder belemmerd door het ontbreken van een diermodel dat de inductie van menselijke ziekten nauw nabootst. We hebben een experimenteel muizenmodel van DIH ontwikkeld met kenmerken die lijken op immuungemedieerde DILI bij patiënten. Hepatitis wordt geïnduceerd door immunisatie met een van de twee autoantigenen die covalent zijn gemodificeerd door de trifluoroacetylchloride (TFA) metaboliet die wordt gevormd na oxidatief metabolisme van het anestheticum door het enzym cytochroom P450 2E1 (CYP2E1)⁵. Eén autoantigeen is de hepatische cytosolische S100-leverfractie, een mengsel van verschillende eiwitten⁶, en het tweede autoantigeen is een epitoop van CYP2E1 dat wordt herkend door sera van patiënten met anesthetisch immuungemedieerd DILI⁷. Door BALB/c-muizen te gebruiken, die relatief resistent zijn tegen experimentele auto-immune hepatitis, onderscheiden we ons model van het S100-geïnduceerde immunisatiemodel van auto-immune hepatitis bij C57Bl/6J-muizen⁸.

Vanwege de diverse klinische presentaties is DIH moeilijk te bestuderen bij patiënten. Translationele experimentele modellen bieden de mogelijkheid om de pathogenese van ziekte in vivo en in vitro te evalueren. Op dit moment zijn er geen andere alternatieve methoden voor het induceren van DIH die in vivo of in vitro adaptieve of aangeboren immuunresponsen volledig onderzoeken zonder het gebruik van dieren. Bovendien, aangezien trifluoroacetylering van S-100 of het CYP2E1-epitoop geen irriterend immunogeen lijkt te produceren, en we DIH induceren door immunisatie met TFA-veranderde eiwitten, zullen deze dieren geen ether, gehalogeneerde verdoving, barbituraat of alcohol ontvangen voorafgaand aan immunisatie of andere procedures, aangezien deze middelen de parameters die we bestuderen kunnen veranderen. Toch hebben we ons muisgebruik verminderd door computersimulatie te gebruiken om de bindingsvoorkeuren van ons ontdekte CYP2E1-epitoop⁹ te bevestigen en hebben we menselijke DIH gespiegeld die vrouwelijk geslacht impliceert door aan te tonen dat vrouwelijke BALB / c-muizen een ernstiger DIH¹⁰ ontwikkelen.

Ondanks diverse presentaties van DIH bij patiënten en uitdagingen in de studie van klinische ziekten, is posttranslationele modificatie van inheemse eiwitten door reactieve geneesmiddelmetabolieten een geaccepteerd sleutelmechanisme in de pathogenese DIH die volgt op gehalogeneerde anesthetica¹¹. Onderzoekers accepteren ook dat CYP2E1 een belangrijk autoantigeen is in dit proces ^12,13. De rol van interleukine (IL)-4-upregulated CD4+T-cellen die een posttranslationeel gemodificeerd CYP2E1 en andere levereiwitten herkennen, is een geaccepteerde initiator van anesthetisch DIH door neutrofielen, eosinofielen en mestcellen in de lever aan te trekken¹⁴, en dit mechanisme is bevestigd in vele vormen van DIH^15,16. Geïnduceerde FoxP3-expresserende CD4+CD25+T-cellen (Tregs) verminderen de ernst van DIH, en relatieve tekortkomingen van deze cellen in de milt verergeren DIH ^10,7. De meeste vooruitgang in het begrijpen van DIH is dus mogelijk gemaakt door gebruik te maken van in vivo muismodellen om de genetische, metabole en immunologische mechanismen van DIH zowel in vivo als in vitro te evalueren.

Omdat wij en andere onderzoekers rollen hebben ontdekt voor IL-4, neutrofielen en eosinofielen bij het initiëren van DIH met behulp van verschillende muismodellen, geloven we dat deze observatie onze bewering ondersteunt dat ongeacht het gebruikte DIH-model, hepatitis en letsel worden geïnduceerd door IL-4. De kracht van ons protocol ligt in het gebruik van in vivo methodologie, zowel mannelijke als vrouwelijke muizen, en herhaling van histologie, CD4 + T-celproliferatietests en cytokines. De kracht van ons gebruik van in vitro studies is dat ze het aantal muizen verminderen dat nodig is, terwijl ze de methodologie bieden om cellulaire interacties te isoleren die DIH aansturen. We raden het gebruik van mannelijke en vrouwelijke muizen aan omdat dit de kans op onbewuste vooroordelen bij de interpretatie van resultaten vermindert en het vertaalpotentieel van onze studies versterkt, omdat de incidentie, prevalentie en ernst van DIH hoger is bij vrouwen¹⁷. We raden aan dat muizen worden verkregen van één leverancier; als dit echter niet mogelijk is, verkrijg dan nestgenootcontroles of wildtypemuizen van dezelfde leverancier als de genetisch veranderde muizen.