高スループット赤痢菌-特定の殺菌試験

このプロトコル WRAIR 被験者保護委員会のガイドラインに従います。本研究で使用されるサンプルは、被験者の保護を管理するすべての機関および連邦政府の規制に準拠して WRAIR プロトコル番号 1328 年の一部として収集された血清サンプルです。サンプルはデ識別され、これらの匿名のサンプルの使用は UAB IRB (プロトコル番号 N150115001) で非人間課題として分類されていた。 1. アッセイ用試薬 準備 1% ゼラチン ゼラチン 1 g を 100 mL の水に追加することによって。オートクレーブと室温で保管します。 2,3,5 – 塩化トリフェニルテトラゾリウム) 原液 100 mg/mL を準備 (1、000 x) TTC の 5 g を水 40 mL に追加することによって。TTC が完全に解散したときは、50 mL の水と滅菌フィルター 0.2 μ m フィルターを使用して、音量を調整します。4 ° C でソリューションを格納し、光から保護します。注:TTC は、細菌のコロニーを色づけしてカウントする簡単になります。TTC のソリューションには、わずかに黄色があります。TTC ソリューションは、赤い色を開発し、破棄、新鮮な準備してください。 10% アジ化ナトリウム (NaN3) ストック溶液 (100 倍) を準備するには、40 mL の水に 5 g ナン3を追加します。完全な分解の後に、50 mL に水を追加します。常温で保存します。注意:アジ化ナトリウムは、毒されており、摂取または目または皮膚から吸収された場合有害である可能性があります。それは鉛と銅配管爆発金属アザイドを形成する反応があります。アジ化ナトリウムを含む試薬の処分のアジ化物のビルドアップを防ぐまたはバイオハザード バッグで破棄する水の大きい容積をフラッシュします。 LB 寒天培地の 35 グラムを 1 リットルの水のオートクレーブに追加することによって、LBA プレート (LB 寒天培地プレート) を準備します。25 mL を各角型シャーレ (120 x 120 mm2) に追加します。寒天を固めるように 10 〜 20 分のための RT でプレートを孵化させなさい。1 ヶ月のビニール袋、4 ° C で店に戻ってプレートを配置します。 寒天の 7.5 g を水 1,000 mL、オートクレーブに追加することで、オーバーレイの寒天を準備します。必要になるまで 56 ° C の水浴で孵化させなさい。使用前に 100 mg/mL と 10 mL の 1 mL を追加 10% ナン3とよく混ぜる。注:各 LBA プレートでは、25 mL の寒天培地のオーバーレイの必要があります。オーバーレイ寒天を覚悟の 1 カ月前に、アッセイのため必要に応じて電子レンジやホット プレートを溶かした。寒天培地の温度が LBA プレートへの適用前に 〜 55 ° C であることを確認します。 40 mL の水に 5 mL の 10 x ・ ハンクスのバランスの取れた塩ソリューション (HBSS) Ca2 +/Mg+2 1% のゼラチンの 5 mL を追加してアッセイのバッファーを準備します。常温で保存します。 2 の補数を準備し、細菌をターゲット 赤ちゃんウサギの補数 (BRC) を準備します。注:補完する多くの選択を見つけることがここで基準を説明: https://www.vaccine.uab.edu/uploads/mdocs/UAB-MOPA.pdf 冷凍 BRC を取得し、冷たい水を実行して解凍します。物理的のミックス、BRC すべての 10 〜 20 分完全に解凍するまで。繰り返し凍結融解に BRC を与えないでください。 BRC を解凍すると中、1.5 mL、5 mL、15 mL の遠沈管にラベルを付けます。場所は、あらかじめ冷たい氷の上の管をラベル付けします。予冷遠心分離チューブに分注適切なボリューム BRC (充填した後、すぐに各チューブに戻る氷)。≤-70 ° C で因数を冷凍庫に格納します。注:補体の約 1 m 各アッセイ プレートが必要です。補完する因数は一人用し、レイアウトを試金する適切なボリュームで避けようとする必要があります。 BRC の熱不活化を準備するには、アクティブ BRC の 1 つの因数分解しなさい。56 ° C の水浴を準備します。BRC を完全に分解した後風呂の水にそれを移すし、30 分間インキュベートします。 インキュベーション後、風呂の水から BRC の熱不活化を削除し、10-15 分ミックス積極的に RT で冷却して 1.5 mL 遠心チューブに分注 〜 150 μ L。≤ で因数を格納-10 ° C ターゲット細菌の在庫を準備します。注:以下の手順を使用して、ターゲット細菌株式の 48 の因数を準備するにはもっと因数が必要な場合、プロトコルをスケール アップすることができます。 マスター ストック冷凍庫からバイアルし、血液寒天培地プレート上にバイアルから氷の少量を削除する冷凍細菌表面をこすり細菌を削除します。マスター ストック バイアルを冷凍庫にすぐに戻ります。 血液寒天培地プレートとプレートふた付けカバーに細菌の在庫のこの小さな因数を連勝します。逆さま一晩 37 °C/5% CO2インキュベーターでプレートをインキュベートします。 流体培養基 LB の 30 mL を含む 50 mL のチューブに 〜 10 隔離された滑らかなコロニーを転送します。培養液がある ~0.6 0.7 の外径 φ600まで穏やかな揺れで 37 ° C で 3-5 時間孵化させなさい。 トップ文化と新鮮な 50 mL チューブへの転送の 12.5 mL を収穫します。テーブル トップ マイクロ遠心分離機を使用して 2 分間 15,000 × gで文化を遠心します。上澄みを廃棄し、再 15% 滅菌グリセリン ポンド 25 mL にペレットを中断します。 よく混合し、0.5 ml を滅菌 1.5 mL マイクロ遠心チューブ (~ 48 管) に分配します。≤-70 ° C で因数を冷凍庫に格納します。 使用する前に凝集反応テストを使用して細菌の id を確認します。 ターゲット細菌株の最適な希釈倍率の決定注:ターゲット細菌の在庫の各バッチは、アッセイ条件 〜 120 CFU/ポンドのプレート上のスポットを生成するために必要な希釈を決定するために滴定する必要があります。 マイクロタイター プレート (希釈プレート) を取得し、1 a をよくアッセイバッファーの 135 μ L を追加します。井戸 1 b ・ 1 H アッセイ バターの 120 μ L を追加します。 冷凍庫から冷凍対象菌のバイアルを削除し、室温で解凍します。細菌の在庫の 10 倍希釈を行うため 1 a をうまく解凍の細菌の在庫の 15ul を追加します。 よく 1b 割増シリアル希釈を実行するも 1 a から細菌のソリューションの 30 μ L を転送します。8 希薄 (1:10 1:50 1: 250; 1:1 250; 1:6 250; 1:31 250; 1:156 250; 1:781 250) の合計に 1 H はよく割増のシリアル希薄を続行します。 別のマイクロタイター プレート (アッセイ プレート) を取得し、アッセイ プレートの 1 と 2 列ですべてが順調にアッセイバッファーの 20 μ L を追加します。 希薄化後の細菌の 10 μ L を希釈板の 1 列目のウェルからアッセイ プレートの 1 と 2 の列に対応する井戸に移転します。細菌の 10 μ L は、よく 1 a および 2 a アッセイ プレート等に希釈板も 1 a から転送されます。 コントロールとコントロール B 手順 3.6 3.12 の前述の血清殺菌アッセイ (SBA) の下のアッセイを続行します。 プレートは、氷の上に培養されている後、は、LBA プレート上に 1 列目の井戸から 10 μ L をスポットに 8 のピペット チップでマルチ チャンネル ピペットを使用します。また、LBA プレート上に 2 列から井戸を見つけます。 3.14 4.6 の手順で以下のとおり分析を続行します。 〜 120 試金で使用される CFU/スポット コントロール B、この希釈で利回り細菌希釈を決定します。 3. 血清殺菌アッセイ (SBA) 注:以下の手順は、1 つのアッセイ プレートがアッセイ プレート数を増やすことができます。 熱不活化 30 分の 56 ° C の水浴でインキュベーターのサンプルでサンプルをテストします。注:テスト サンプルは、テストが、内因性補体活性を破棄する前に熱不活化する必要があります。これはアッセイの前に行うことができ、不活化サンプルを再凍結またはテストまで 4 ° C で保存することができます。 アッセイ プレートを取得、列 1 の行 A g. 追加 20 μ L からアッセイバッファーの 1 と 2 の H の行の列に 12 ~ アッセイバッファーの 20 μ L を追加の表 1を参照してください。 アッセイ プレートの H の行を重複して各テスト サンプルの 30 μ L をロードします。たとえば、3 H、4 H、井戸にサンプル 1 の 30 μ L を分注、5 H と 6 H の井戸等にサンプル 2 の 30 μ L を分注します。 マルチ チャンネル ピペットを使用して試料の 3 倍のシリアル希薄を実行します。 行 G で 10 の井戸 3-12 H からサンプルの μ と対応する井戸への転送を削除し、上下にピペッティングでよくサンプルをミックス 8-10 回。 F の行 10 の 3 G、12 G の井戸から μ と対応する井戸への転送を削除し、よく混ぜます。 A. 行を通じてこれらのシリアル希薄を続けるA の行で井戸を混合した後削除し、20 μ l を含むすべての井戸井戸 3A-12 a から 10 μ l を破棄します。注:20 μ L の血清を 80 μ L の合計アッセイ ボリュームのため、試金の 4 倍追加希釈があります。この希釈は、4 血清の希釈を乗じて SBA 価の計算時にアカウントに撮影する必要があります。たとえば、1:2 の開始の希釈を使用すると、テストされている実際の希釈は 1:8 です。 冷凍室温で融解ターゲット細菌の 1 つのバイアルを削除します。(この希釈倍率はセクション2.3で決定された) 前もって決定された最適な希釈倍率によると 20 mL のアッセイ バッファー内の細菌を希釈します。マルチ チャンネル ピペットを使用してアッセイ プレートの各ウェルに希釈した細菌の 10 μ L を追加します。 熱不活化 BRC、冷たい水を実行して室温で融解凍結冷凍 BRC のバイアルとの 1 つのバイアルを削除または生物学的安全性の格子にすばやく解凍に空気を吹くとキャビネットを配置します。 BRC の熱不活化の 20% 溶液を準備します。ミックス 100 μ L の熱不活化 BRC アッセイバッファーの 400 μ L で。列 1 (コントロール A 井戸) のすべての井戸にこの 20% の熱不活化 BRC 溶液 50 μ L を追加します。注:BRC の熱不活化は試金の非特異的殺害 (NSK) を監視するコントロールとして使用されます。 ネイティブ BRC の 20% 溶液を準備します。アッセイバッファー 4 mL とネイティブ BRC の 1 mL を混ぜます。列 2 ~ 12 (コントロール B とテスト サンプル井戸) のすべての井戸にこの混合物の 50 μ L を追加します。注:反応混合物に BRC の最終濃度は 12.5% です。 簡単にミックス アッセイ プレート プレート シェーカーで 10-15 s の優しく揺することによってまたはマルチ チャンネル ピペットを使用して 8 回上下ピペッティングで混ぜます。 (揺れ) なし 2 時間 37 ° C 微生物インキュベーターでアッセイ プレートを置きます。 蓋の取り外しプレートを配置することによって乾燥 2 LBA プレートは生物学的安全キャビネット 40-60 分間で立ち向かいます。 2 時間培養が完了したら、氷をウェットし、反作用を停止する 10-20 分間インキュベートするアッセイ プレートを移動します。 12 チャネル ピペッティング システムを使用して、行 H、LBA プレートの下部に反応混合物のスポット プレート 10 μ L の井戸をミックスします。すぐに板を傾けるし、~1.5-2 cm。 行 G、F、E、LBA プレートの前の行の上にそれらをスポッティングのこの手順を繰り返し実行するスポットを許可します。LBA プレートと行の A、B、C、および D は同様に 2 番目の LBA プレート発見が 1 つ上に行の E、F、G、および H が発見され、図 1を参照してください。 ソリューションが LBA のプレート (10-15 分) に吸着するまで室温で LBA 版を孵化させなさい。LBA プレートの蓋を入れて、微生物のインキュベーターで一晩インキュベートする逆さまの LBA プレートを配置 (16 〜 18 h)。S. 菌2 a と 3 a 29 ° c の孵化し、孵化させなさいS. 体は 26 ° c.注:これらの温度は、小さい「マイクロ-植民地”コロニー カウンター9による正確なカウントに適した規模をもたらします。 一晩インキュベートした後 100 μ g/mL TTC と各 LBA のプレートに 0.1% ナン3を含む (〜 55 ° C) でオーバーレイ寒天の 25 mL を追加します。 下の図 1を参照してください、赤い色を開発する存続の細菌を許可するように 2 h の 37 ° C で LBA 版を孵化させなさい。 デジタル カメラを使用してプレートを写真し NIST の統合されたコロニー列挙ソフトウェア (ニース) がインストールされているコンピューターにイメージを転送、図 2を参照してください。注:素敵なコロニー カウント ソフトウェアは無償でご利用いただけます。詳細およびインストール手順については、材料のリストを参照してください。 4. カウント細菌コロニー オープンの素敵なソフトウェアと入力オペレーター名、実験については、空のフィールドにノートの試金します。このデータを入力した後、[ Done ] ボタンをクリックします。 撮影板をインポートするには、 [開く] ボタンをクリックして、コンピューターから適切なファイルを選択します。 アッセイ パラメーターを調整するには、行の数を 4 と 12列の番号に設定できます。-3 シグマに背景設定と低解像度を調整します。図 2を参照してください。 クリックしてドラッグして各 ROI が 1 つサンプル スポットの上に直接関心領域 (Roi) に移動します。すべての細菌のコロニーが重ならないのサンプルの間で投資収益率内部がようにします。1 つのプレートが完了すると、保存されているデータのイメージのリスト内の次の板をダブルクリックし、Roi を調整します。図 2を参照してください。 すべてのプレートを調整すると、緑のカウントボタンをクリックして、図 2 と図 3を参照してください。カウントが終了は、.xls/.xlsx の形式でデータをエクスポートするのには [エクスポート] ボタンをクリックします。データ解析のための.xls/.xlsx ファイルに名前を付けて保存します。 数が 96 ウェル アッセイ プレートを表す表に編成できるように、表形式にエクスポートされたデータを整理、参照してください表 2. 5. 計算 SBA 価 (KI) と非特異的殺害 (NSK) 注:SBA 価または殺害インデックス (KI) は標的細菌の 50% を殺す血清希釈の逆数として定義されます。 アクティブな補完コントロール井戸 (コントロール B) CFU を平均して 2 で割ることによってインデックス (KI) カットオフ値を殺す 50% を計算します。複製で実行した各サンプルの各希釈用平均 CFU を計算、表 3を参照してください。 血清希釈がこの 50 %ki 値正確を得られることはほとんどありませんので、それは 2 つシーケンシャル血清希釈液、50% 未満を殺すと、50% 以上を殺すから補間することができます、図 4を参照してください。補間された SBA 氣を計算する数式を次に示します。注:殺菌力価や気には UAB によって開発された Opsotiter ソフトウェアを使用して自動的にも計算できます。要求 Opsotiter に博士月 Nahm または氏ロブ ・ バートンに問い合わせてください。連絡先については、https://www.vaccine.uab.edu を参照してください。 コントロール B コントロール a. の平均で割った値の平均を引いた値 1 を撮影する NSK 値を算出します。