Manipulação e avaliação da cultura de organoides humano de próstata primário

O protocolo seguinte foi otimizado usando humanas primária da próstata células epiteliais colhidas do paciente tecido da Universidade de Illinois, no Hospital de Chicago. Todos os tecidos humanos utilizados para estas experiências foram adquiridas através de um Conselho de revisão institucional aprovado protocolo e/ou isenção na Universidade de Illinois em Chicago. Enquanto as condições de cultura irão variar dependendo do tipo de célula de interesse, os pontos de extremidade podem ser aplicados a organoids de outros tecidos. 1. semeadura de células epiteliais em Gel Matrix e alteração de mídia Coletar os materiais necessários: humanas primário da próstata células epiteliais (pré), gel de matriz no gelo, microplacas de 96 poços, queratinócito media serum-free (KSFM) no gelo, carvão, despojado de soro fetal bovino (FBS) e dihidrotestosterona (DHT). Prepare a mídia baseada em KSFM organoides combinando 47,5 mL de KSFM com 2,5 mL de carvão FBS despojado e dihidrotestosterona (DHT) a uma concentração final de 10 nM DHT, então reserva no gelo. Células de placa em uma matriz 3D em uma capa de cultura de células utilizando uma técnica estéril. Delicadamente mistura fria mídia baseada em KSFM organoides com gel de matriz gelada para obter uma matriz de 50% do gel mistura por lentamente pipetagem para cima e para baixo, evitando bolhas.Nota: Matrix gel deve ser descongelado durante a noite a 4 ° C e mantido no gelo, sempre que possível. Ela se solidifica rapidamente à temperatura ambiente (RT). Pre-molhado uma ponta da pipeta no criogênicos e transferência 40 – 50 μL de matriz 50% gel na parte inferior de cada poço deve ser usado em uma placa de 96 poços. Cubra o fundo do poço para formar uma camada de base.Nota: Não dispensa totalmente a segunda paragem na pipeta, como isso pode criar bolhas. Coloque a placa de 96 poços em incubadora 37 ° C por 30-45 min solidificar a camada de base.Nota: Não placa células epiteliais para a camada de base até que tem solidificado, ou células podem cair pela matrix na parte inferior da placa e crescer como uma monocamada. Misture suspendidas na mídia baseada em KSFM organoides com 33% matriz gel e gel de matriz para obter uma concentração final de 100 – 1.000 células/100 μL de células epiteliais. Células epiteliais de placa em cima de camadas de base usando 100 μL de mistura de gel/célula matriz 33% por poço.Nota: Experiências anteriores mostraram que a propagação de células epiteliais também densamente em 3D irá restringir o tamanho de crescimento de organoides, enquanto também escassamente semeadura pode resultar em muito baixo rendimento13. É importante otimizar as condições de propagação para o tipo de célula de interesse, com base na eficiência de formação paciente específico organoides. Coloque a placa de 96 poços em uma incubadora de 37 ° C por 30-45 min permitir que o gel de matriz solidificar e, em seguida, delicadamente, adicionar 100 μL de mídia baseado em KSFM organoides em cima de células pipetando lentamente contra a borda do poço. Altere os meios de comunicação a cada 2-3 dias. Pipetagem contra o lado do bem com o espaço entre a mídia e matriz de gel, Retire cuidadosamente 50 μL de mídia e substituir com 50 μL de mídia fresca.Nota: Para uma cultura de longo prazo, o gel da matriz precisa ser mudado a cada 2-3 semanas. Se a cultura de gel de matriz aparece instável e exibe rugas translúcidas sob o microscópio, o gel da matriz está quebrado para baixo e precisa ser substituído. 2. coleção de Organoids de Gel Matrix Nota: A coleção de organoids é necessária para alterações de gel de matriz, passagem ou pontos de extremidade de extração de RNA, extração de DNA, extração de proteínas e citometria de fluxo. Protease neutro morna e Hanks equilibrada solução salina (HBSS) em banho maria a 37 ° C. Cuidadosamente remova a mídia de poços sem interromper o gel da matriz. Adicionar ~ 200 μL de protease neutro a cada poço em um ~ 1:2 rácio de protease de matriz gel: neutro e incube por 20 min a 37 ° C. Mecanicamente, dissocia a mistura de protease matriz gel: neutro pipetando para cima e para baixo. Incubar durante 20 min a 37 ° C. Transfira a mistura de gel de célula de protease neutro-matriz para um tubo de microcentrifugadora ou tubo cônico, dependendo do volume. Centrifugar a 300 x g durante 3 – 5 min para células de Pelotas.Nota: Se não centrifugado aparece, o gel de matriz não pode ser completamente dissociado e pode ser visualizado como uma fase translúcida na parte inferior do tubo distinto do sobrenadante de cor de rosa. Remover o sobrenadante e adicionar protease mais neutro na proporção de 1:2 a matriz a pelota de gel, incubar por mais 20 a 40 minutos a 37 ° C e repetir a centrifugação a 300 x g. Quando é adquirido um pellet de organoides, remova o sobrenadante. Prosseguir com a passagem (consulte a etapa 2.7.1), organoides Lise para extração de RNA, DNA ou proteína (consulte a etapa 2.7.2), único de processamento de células por citometria de fluxo e sequenciamento de célula única (ver passo 2.7.3). Para cultura a longo prazo, Ressuspender delicadamente organoids intacta em 33% matriz fresco gel e placa seguindo as etapas descritas em etapas 1.1 – 1.5. Para dissociar organoids e replate como células únicas, resuspenda o pellet em 1 mL de enzimas da célula quente-dissociação e incubar a 37 ° C, durante 10 a 15 min, lave uma vez com 5 mL de HBSS e re-placa no gel fresco matriz seguindo passos 1.1 – 1.5. Resuspenda o pellet de organoides em um tampão de Lise adequado para extração de RNA, extração de DNA ou extração da proteína, conforme listado na Tabela de materiais e seguir o protocolo do fabricante. Resuspenda organoids em 1 mL de enzimas da célula quente-dissociação e incubar a 37 ° C por 10 a 15 min dissociar o organoids em células únicas. Lave uma vez com 5 mL de HBSS e prosseguir com o protocolo para fluxo cytometry5 ou célula única sequenciamento18.Nota: Para dissociar em células únicas em baixas concentrações de gel da matriz, a protease neutra pode não ser necessária, e enzimas da célula-dissociação podem ser aplicadas diretamente ao poço, depois passo 2.2. 3. todo-bem imagem aquisição e análise da morfologia de organoides Adquirir imagens de todo bem z-pilha usando um microscópio invertido luz transmitido com uma motorizada X / Y digitalização palco (fluxo de trabalho, ilustrado na figura 1A). Com a posição focal ajustada para o fundo do poço, começa com foco para cima até encontrar a primeira organoides, que será no centro do poço devido o menisco da camada de base. Defina o z-plano de fundo nessa posição. Continue concentrando-se para cima até que o último organoides em foco, que será na periferia do poço. Defina o z-plano superior nessa posição.Nota: Depois de definir a parte superior e inferior da pilha-z, certifique-se que estas posições capturar o organoids dentro de todos os restantes poços e ajustar a cima/baixo, conforme necessário. Isso permite que o z-intervalo a ser usado para uma varredura única que inclua todos os organoides dentro de cada poço. Capture a 15 – 35 z-aviões por bem, usando um número maior de maior resolução. Capturar a imagem bem inteira, mesclar e coletar quadrantes ou subseções se necessário.Nota: É aconselhável levar vários z-aviões em vez de um único plano z, conforme ilustrado na figura 1B , em que organoids estão fora de foco quando capturar apenas um z-plano. Salve imagens de z-pilha para análise a jusante. Analise imagens usando o software de imagem com recursos de desenho de forma livre. Abra uma única imagem de z-plano conjunto de passo 3.1.4. Se necessário, telha as imagens tomadas em cada plano z individual em uma imagem única de todo bem. Salve a nova imagem como um arquivo separado. Repita este processo para cada z-plano adquirido. Usando o software de imagem, abra a imagem de todo o bem para todos os z-plano de um único poço e criar uma estendido profundidade de campo (FED) imagem da pilha de z-aviões.Nota: Este tipo de imagem irá selecionar a melhor região de foco de cada z-plano para criar uma única imagem em foco do poço. Defina a escala de pixel do software à barra de escala da imagem que está sendo medida. Usando a ferramenta de desenho de forma livre o software de imagem, traçar o perímetro de cada organoides no poço. Obter as métricas de medição para perímetros de organoides rastreados a partir do software de imagem.Nota: Parâmetros recomendados são área, circularidade e relação raio máximo/mínimo. Resultados representativos, ilustrando a aplicação dessas métricas são mostrados na Figura 1. Área é calculada a partir do polígono definido pelo perímetro dos organoides. Circularidade é a proporção da área dos organoides para a área de um círculo com furão máximo do diâmetro igual a organoides, onde 0 é menos circular e 1 é mais circular. Relação máxima/mínima raio é a razão entre o raio máximo e o raio mínimo dos organoides rastreados.Circularidade =Relação raio = 4. parafina e fixação de formalina incorporação de Organoids para pontos de extremidade histológicos Preparar suprimentos encastre: HBSS, 2% solução de ágar, marcação histológica tintura, gel de histologia, pipetar molde de ponta, fita, êmbolo de uma seringa de insulina 1 cc, bolsa de gelo, cassettes, 10% de formalina tamponada neutro (NBF), lápis e etanol de grau histológico de 75% (EtOH). Prepare dois tubos microcentrifuga de solução de ágar de 2%. Incube em banho-maria ou num bloco de calor 100 – 110 ° c para manter o agar em forma líquida. Adicione 1 a 2 gotas de histológica marcando tintura para uma das soluções de 2% de ágar, que irão designar o topo do ágar plug e auxiliar na manutenção da orientação durante a incorporação. Misture bem. Aquecer o gel de histologia em banho-maria ou calor num bloco de 55 e 65 ° c. Usando uma ponta de pipeta 1000 μL, crie moldes por cortar uma pequena parte da ponta da pipeta para fazer um cilindro que contém ~ 50 μL. Crie um molde de segundo, mais amplo que se encaixa em torno do primeiro molde. Crie um bloco frio pelo envolvimento de um bloco de gelo com fita (adesivo para cima) e aderindo moldes para a fita. Crie um êmbolo, removendo o êmbolo de uma seringa de insulina 1 cc. Incorpore o organoids em um plugue de gel de histologia para processamento, seguindo o fluxo de trabalho representado na Figura 2A. Pelota organoids seguindo passos 2.1 – 2.7 e dissociar o gel da matriz. Lave o sedimento de organoides uma vez com 1 mL de HBSS re-pelota e girando para 3-5 min a 300 x g e retirar o sobrenadante. Ressuspender o pellet de organoides em 30 – 50 μL de gel líquido histologia. Misture suavemente pipetando para cima e para baixo lentamente. Transfira a mistura de gel/organoides de histologia em um molde do bloco frio e permitir que a amostra esfriar e solidificar em um plugue. Utilize um êmbolo para empurrar o plugue fora do molde pequeno e no molde maior. Pipeta clara 2% agar em torno a ficha para preencher o molde maior. Pipete 2% tingido de corante histológico agar em cima a ficha para denotar o topo da amostra. Uma vez arrefecido, use um desentupidor para transferir o plug dentro de um estojo de histologia. Rotular a fita usando um lápis e lugar gaveta em 10% NBF para fixação durante a noite. A fita de transferência de 10% NBF para 70% grau histológico EtOH. Processo do gel de histologia conecte usando um protocolo pré-estabelecido biópsia em um processador, se disponível. Se a predefinição não está disponível, entrada a seguinte sequência e comprimentos: 70% EtOH por 6 min, 70% EtOH por 10 min, 80% EtOH por 10 min, 95% EtOH 2 vezes por 10 min, 100% EtOH 3 vezes por 10 min, xileno por 15 min por 3 vezes , e parafina por 15 min. por 3 vezes o recomendado Deviating sequência de processamento pode resultar em ruptura organoids (Figura 3A). Inserir a ficha do gel de histologia com a parte colorida voltada para cima, que permitirá a parte descolorida contendo o organoids para ser seccionado em primeiro. Seção a histologia FFPE gel blocos: Coletar suprimentos necessários: histologia FFPE gel blocos, caneta de histologia, banho de água do tecido flutuador, balde de gelo com gelo, micrótomo, lâminas do micrótomo, incorporação de estação de trabalho, carregados positivamente corrediças do microscópio e forno de laboratório. Banho de água de preenchimento até muito completo e conjunto a 40 ° C e, em seguida, forno pré-quente laboratório de 45-50 ° C. Preparar um balde de gelo, em seguida, encher com gelo e adicione água para criar uma pasta de água gelada. Refrigere os blocos de gelo até eles são muito frios.Nota: Blocos podem ser definidos no gelo por até 1 dia, mas se deixada durante a noite, os blocos irão tornar-se hidratado e precisarão ser reprocessada. Inserir um bloco na braçadeira de fita do micrótomo, adicionar a lâmina para o porta-navalha e desbloquear qualquer medidas cautelares de bloqueio na máquina. Comece por aparar o rosto do bloco de parafina (para) com uma espessura de 10 µm. Uma vez que uma seção que contém a área de plug emerge, parar o aparamento, travar o rotor micrótomo e transferir o bloco de volta para o gelo para descontrair. Se vários blocos devem ser seccionados, face-off cada bloco antes de passar para a etapa 4.5.6. Mova a lâmina para uma porção de nova, não… e transferir o bloco de volta para o grampo. Desbloquear a máquina e começar a aparar a 5 μm por seção.Nota: para obter melhores resultados, recomenda-se 5 μm, mas 3 – 10 μm também é aceitável. Usando uma pinça, a seção de transferência para o banho de água de 40 ° C e permitir que a seção para se espalharem. Transferi a secção numa lâmina mergulhando verticalmente na água.Nota: Mergulhando em um ângulo pode transferir as bolhas do fundo da banheira para a seção e causar distorção da amostra. Visualize a seção sob o microscópio (Figura 2BC).Nota: Se um organoides presentes, parecerá semelhante a seta vermelha na figura 2B. Bolhas (Fig. 2B, seta azul) podem aparecer semelhantes ao organoids e são mais fáceis de discernir em um slide-fresco como secos organoids aparecer translúcido (Figura 2). Se não organoids estão presentes, seção ainda mais no bloco. Quando slides contendo organoids tenham sido adquiridos, circule a área ao redor da seção na parte de trás do slide com uma caneta de histologia e coza durante a noite em 45-50 ° C. Coletar slides e siga a H & E (consulte a etapa 4.9.1), imuno-histoquímica (consulte a etapa 4.9.2), ou imunofluorescência de coloração (Veja passo 5).Nota: Resultados representativos são mostrados na Figura 3B. Para executar H & E mancha, obter um kit de lista de materiais e seguir as especificações do fabricante. Para executar a coloração imuno-histoquímica, obter um kit e o anticorpo primário da lista de materiais e seguir as especificações do fabricante. 5. imunofluorescência coloração da FFPE e seccionado Organoids Coletar suprimentos: slide cozido da etapa 4, xileno, 100% EtOH, 95% EtOH, 70% EtOH, água deionizada (DI H2O), coplin frascos, 1 x antígeno recuperação solução (tampão citrato de sódio ou tampão Tris-EDTA), tampão fosfato de soro fisiológico (PBS), 5% (de soro de cavalo normal NHS) com detergente não-iônico de 0,1% em PBS, 1% albumina de soro bovino (BSA) com detergente não-iônico de 0,3% em PBS, cremalheira de coloração, coloração de prato, bem à câmara, caneta de barreira hidrofóbica, câmara de umidade, 1 ° e 2 ° os anticorpos de interesse e counterstains de interesse. Deparaffinize e Re-hidratar os slides por mergulhando coplins preenchido com as seguintes soluções: xileno (3 mergulhos, 5 min cada), 100% EtOH (2 mergulhos, 3 min cada), 95% EtOH (2 mergulhos, 3 min cada), 70% EtOH (2 mergulhos, 3 min cada) e DI H2O (2 mergulhos 3 min cada). Encher o prato de coloração com a solução de recuperação de antígeno e pré-aqueça bem à câmara a 100 ° C. Executar a recuperação do antígeno imergindo slides no prato pré-aquecido coloração e incubar durante 5-10 min a 100 ° C. Uma vez que o ciclo está completo, permitir que a câmara decloaking descansar por 20 min antes de abrir a tampa. Uma vez que o prato de slide esfriou a RT, coloque o prato coloração sob corrente DI H2O para enxaguar os slides por 5 min. Remover as lâminas do prato coloração, desenhar um círculo ao redor da amostra com uma caneta de barreira hidrofóbica e colocar o slide na câmara de umidade. Bloquear qualquer anticorpo específico coloração aplicando 5% NHS com detergente não-iônico de 0,1% em PBS ao círculo hidrofóbico ao redor da amostra (cerca de 30 μL é necessária para cobrir a amostra). Slides de lavagem em coplins preenchido com PBS 3 vezes durante 5 min cada. Adicionar os anticorpos de 1° (Tabela de materiais), diluídos em 1% BSA com detergente não-iônico 0,3% em PBS ao círculo hidrofóbico ao redor da amostra (cerca de 30 μL deve cobrir a seção), então incubar durante 1 h no RT ou durante a noite a 4 ° C, em câmara de umidade. Lave as lâminas em coplins preenchido com PBS 3 vezes durante 5 min cada. Adicione o anticorpo de 2° diluído em 1% BSA com detergente não-iônico 0,3% em PBS ao círculo hidrofóbico ao redor da amostra (cerca de 30 μL cobrirá a área), então incubar durante 1 h a RT na câmara de umidade. Lave as lâminas em coplin preenchido com PBS 3 vezes durante 5 min cada. Adicionar DAPI, diluída-se para as especificações do fabricante, em 1% de BSA com detergente não-iônico 0,3% em PBS ao círculo hidrofóbico ao redor da amostra, e incube por 2 – 5 min em RT no escuro (30 μL). Lave as lâminas em coplins preenchido com PBS 3 vezes durante 5 min cada. Montar as lâminas com mídia de montagem antidesgaste e lamela e, em seguida, Visualizar os resultados sob um microscópio. 6. toda a montagem de Organoids para a coloração imunofluorescente Coletar suprimentos: slide de câmara ou prato confocal, tampão fosfato salino (PBS), fixador, 50mm NH4Cl em PBS, 0,1% de detergente não-iônico em PBS, NHS 5% com detergente não-iônico de 0,1% em PBS, 1% de BSA com detergente não-iônico de 0,3% em PBS, 1 ° e 2 ° anticorpos de interesse e counterstains de interesse. Remova cuidadosamente a mídia tanto quanto possível sem interromper a cultura de organoides pipetando contra o lado do bem, deixando espaço entre mídia e matriz de gel. Usando uma aparada, pre-molhado com mídia ou PBS, 1.000 ponta da pipeta μL, elaborar uma gota (25 – 50 μL) de gel de matriz que contém o organoid(s) de interesse e dispensar no meio de um prato de bem ou confocal de slide do câmara.Nota: 33% gel de matriz não é um sólido. É um fluido gelatinoso que manipula semelhante a uma gelatina que não totalmente definido. Uma ponta de pipeta aparadas com uma grande abertura impedirá organoids quebra durante as transferências. Se organoids permanecem na cultura pai, substitua a mídia com mídia baseada em KSFM quente. Com o olho nu ou escopo de dissecação, Aspire o excesso de gel matriz e mídia no slide de câmara com uma pipeta de ponta fina (10-200 μL) de.Nota: É opcional para pretreat o slide de câmara com um reagente de aderência. Um volume igual de gel de matriz em um poço vazio do slide câmara da placa como um controle opcional para observar autofluorescência de matriz de sobra. Coloque o slide de câmara em uma incubadora de 37 ° C por 30-45 min promover os organoides para aderir ao vidro e evitar a perda de amostras durante as etapas de lavagem. Pipetagem lentamente para evitar o desprendimento de slide, lavar organoids com 200 µ l de PBS 1x por 5 min em RT, agitando suavemente. Remova o 1X PBS e correção com 200 μL de paraformaldeído 4% durante 30 min à RT agitando suavemente. Certifique-se de que o gel da matriz aparece claro após esta etapa.Nota: Fixação de metanol ou formalina também são possíveis. Método de fixação deve ser otimizado para anticorpos específicos, como certos métodos de fixação podem crosslink os antígenos de interesse ou saciar fluorescente-rotulagem-proteínas de interesse. Retire o fixador e lavar duas vezes com 200 µ l de PBS 1x por 5 min, agitando suavemente.Nota: O comprimento das etapas de lavagem deve ser otimizado dependendo do tamanho de organoides. Cinco minutos é um ponto de partida suficiente, mas a etapa de lavagem pode ser alongada, conforme necessário. Saciar a autofluorescência com 200 μL de 50mm NH4Cl em 1X PBS durante 30 min à RT agitando suavemente.Nota: Este passo saciarão autofluorescência de detritos no lúmen dos organoides e da expressão da proteína fluorescente (tais como GFP) que pode apresentar do delineamento experimental. Deve ser incluído se for desejado para usar um fluoróforo no canal 488, mas pode ser ignorada se desejar preservar o sinal GFP. Remova NH4Cl e lavar duas vezes com 200 µ l de PBS 1x por 5 min, agitando suavemente. Permeabilize organoids em 200 µ l de detergente não-iônico 0,1%-100 em 1X PBS durante 30 min à RT agitando suavemente. Remova o detergente não-iônico-100 de 0,1% em 1X PBS e lavar duas vezes com 200 µ l de PBS 1x por 5 min, agitando suavemente. Bloco com 5% de NHS com 200 μL de detergente não-iônico 0,1% X-100 em PBS e incubar por 60 min em RT, agitando suavemente. Retire o tampão de bloqueio e lavar duas vezes com 200 µ l de PBS 1x por 5 min, agitando suavemente. Diluir o anticorpo 1° em 1% de BSA com 0,3% Triton X-100 em PBS 1x e adicionar a 200 μL do slide câmara e, em seguida, incubar 1 – 3 dias a 4 ° C. Remover o anticorpo de 1° e lavar duas vezes com 200 µ l de PBS 1x por 5 min, agitando suavemente. Diluir o anticorpo de 2° em 1% de BSA com 0,3% Triton X-100 em PBS 1x e adicionar a 200 μL do slide câmara e, em seguida, incubar 1 – 3 dias a 4 ° C, no escuro.Nota: O comprimento dos tempos de incubação deve ser otimizado para anticorpo e tamanho de organoides. Alguns exigirá mais tempo para penetrar os organoides. Concentração de anticorpo também precisará ser otimizado. Em geral, 2x a concentração utilizada para as seções FFPE é apropriada para detecção de anticorpos de 1° e a mesma concentração para seções FFPE é apropriada para detecção de anticorpos de 2°. Remover o anticorpo de 2° e lavar duas vezes com 200 µ l de PBS 1x por 5 min, agitando suavemente. Counterstain a actina com faloidina e o núcleo com DAPI ou Hoescht, diluída de acordo com as recomendações do fabricante em 1% de BSA com 0,3% Triton-X em 1X PBS. Adicionar 200 μL a câmara slide e, em seguida, incubar a RT por 40 min no escuro. Montar em 200 μL de frescos 1X PBS ou mídia de montagem e imagem imediatamente (fluorescência deve ser preservada por até 5 dias, se não mais). Resultados representativos são mostrados na Figura 3.Nota: A azida de sódio pode ser adicionada para amostras para evitar a contaminação, se imagem latente confocal não está prontamente disponível. Adicionar um despachante pode melhorar a imagem. 7. toda a montagem de Organoids para ensaios e sondas fluorescentes Nota: Existem ensaios disponíveis comercialmente e sondas/corantes fluorescentes (exemplos são incluídos na lista de materiais) alteráveis para uso na organoids todo montado para observar uma variedade de pontos de extremidade útil19. O seguinte protocolo é para o kit de proliferação EdU fluorescente etiquetado, no entanto, qualquer jogo pode ser modificado para uso com uma amostra de todo montado. Cuidadosamente retire 50 μL de mídia e substituir com 50 μL de 20 μM 2 x EdU solução de trabalho, pipetando contra o lado do bem, deixando espaço entre mídia e matriz de gel. Incube a 4 ° C por 1 – 3 dias (a duração desejada para a incorporação de EdU deve ser otimizada para o tipo de célula de escolha). Siga os passos 6.2 – 6,8 para transferir o organoids de interesse em um slide de câmara ou prato confocal. Remover o PBS e corrigir com 200 μL de paraformaldeído 3,7% durante 30 min à RT agitando suavemente. Certifique-se de que a matriz de gel aparecem claras após esta etapa. Retire o fixador e lavar duas vezes com 200 µ l de PBS 1x por 5 min, agitando suavemente. Remova o PBS e adicione 200 μL de detergente não-iônico de 0,5%-100 em 1X PBS durante 30 min à RT agitando suavemente. Prepare um 1x fluorescente reação cocktail de acordo com as especificações do fabricante. Remover o detergente não-iônico de 0,5%-100 e lave duas vezes com 200 μL de BSA de 3% em PBS 1x por 5 min, agitando suavemente. Adicione o cocktail de reação e incube por 30 min em RT no escuro. Remova a reação fluorescente cocktail e lave uma vez com 200 μL de 3% BSA em PBS 1x por 5 min, agitando suavemente. Corante de contraste e montagem, seguindo os passos de 6,21 – 6.22 (Figura 3D).