نقدم هنا، بروتوكولا لدليل المناولة البشرية أورجانويد البروستاتا الأولية ثم تشير إلى نقاط النهاية لتقييم النمط الظاهري. البذر، ثقافة الصيانة والانتعاش من جل مصفوفة، يرد وصف الكمي مورفولوجك والتضمين وتمزيقها وتمزيقها فب، الجامعة-جبل تلطيخ وتطبيق الاختبارات التجارية.
وتصف هذه الورقة بروتوكول مفصل لثلاثي الأبعاد (3D) استزراع والمناولة، وتقييم البشرية الأساسي أورجانويدس البروستاتا. وتنطوي العملية على زرع الخلايا الظهارية قليلة في جل مصفوفة ثلاثية الأبعاد على ميكروسكوبية 96-جيدا مع التغييرات الوسائط لزراعة التوسع في أورجانويدس. ثم يتم تقييم مورفولوجيا بالجامعة، حسنا التقاط الصور z-المكدس. ضغط z-مكدسات يخلق صورة واحدة في التركيز من خلالها يتم قياس أورجانويدس التحديد الكمي لمجموعة متنوعة من النواتج، بما في ذلك تدوير والدائرية، والمنطقة. ويمكن جمع الحمض النووي، والجيش الملكي النيبالي، والبروتين من أورجانويدس استردادها من جل المصفوفة. يمكن تقييم بالانفصال أورجانويد السكان خلية للفائدة والتدفق الخلوي. الفورمالين-التثبيت-البارافين-التضمين (FFPE) متبوعاً بتقطيع يستخدم لتقييم غذائها وتلطيخ جسم. تلطيخ الجامع-جبل إيمونوفلوريسسينت يحافظ على مورفولوجيا أورجانويد ويسهل المراقبة للتعريب البروتين في أورجانويدس في الموقع. يمكن تعديل فحوصات التجارية التي تستخدم عادة لخلايا أحادي الطبقة 2D أورجانويدس ثلاثي الأبعاد. تستخدم معا، توفر التقنيات في هذا البروتوكول مجموعة أدوات قوية لقياس نمو البروستاتا أورجانويد وخصائص السمات، والتعبير عن علامات التمايز.
أورجانويدس أداة قيمة لدراسة أورجانوجينيسيس والمرض. أنها توفر بديلاً أقل تكلفة للنماذج الحيوانية، وتتطور أورجانويدس المستمدة من المريض كاستراتيجية للطب شخصية1،،من23. ينطوي هذا النظام ثلاثي الأبعاد (3D) ثقافة زرع الخلايا الجذعية أو السلف (تحصد من الأنسجة أو بفعل الخلايا الجذعية pluripotent) في جل مكونات المصفوفة خارج الخلية (مصفوفة جل)4. تتكاثر الخلايا والتفريق، أسفر عن هياكل أورجانوتيبيك أن الخص في التسلسل الهرمي للهاتف الخلوي ومورفولوجيا الجهاز لوحدة وظيفية للفائدة. وقد نمت أورجانويدس استخدام الخلايا التي تنشأ من مجموعة متنوعة من الأجهزة، بما في ذلك الغدة اللعابية، المعدة، الأمعاء، الكبد والبروستاتا، والرئة، والمخ4. على الرغم من أن هناك بروتوكولات عديدة تصف الخطوات إنشاء5،أورجانويدس البروستاتا6، أنها تمثل تحديا لإيجاد طرق مفصلة بما فيه الكفاية حول كيفية تحقيق النهاية الكمية من أورجانويدس. هذه الورقة يلخص الأساليب المتقدمة لخلايا البروستاتا الأساسي الإنسان وتفاصيل سلسلة من نقاط النهاية المقترحة لتقييم تعمل أورجانويد. هذه التقنيات كانت الأمثل للبروستاتا أورجانويدس ويمكن أن تنطبق على سائر الثقافات الخلية 3D.
الثقافات أورجانويد البروستاتا ظهرت مؤخرا كما أنشأت نموذجا قيماً في المختبر الذي يفتقر إلى القيود المفروضة على ثقافات أحادي الطبقة باستخدام خطوط الخلايا مخلدة. ظهارة البروستاتا الحميد وسرطان البروستاتا التحدي لنموذج في المختبر باستخدام خطوط الخلايا مخلدة. العدد خطوط الخلايا حميدة محدودة، والجميع قد شهدت تحولاً مع المسرطنة7. لا تفرق في الخلايا لومينال الخلايا الظهارية البروستاتا الأولية في مونولاييرس ونقص الاندروجين مستقبلات8. لا تملك غالبية خطوط خلايا سرطان البروستاتا مستقبلات الاندروجين الوظيفية، ووسيط هام المبكر مرض الدولة، والافتقار إلى التغيرات الوراثية الرئيسية التي وجدت في أورام المرضى9. الثقافات أورجانويد البروستاتا يمكن زراعتها بسهولة من ظهارة حميدة، وهي ذات قيمة في دراسة خصائص الخلايا الجذعية وخلايا السلف، والتمايز، وآثار التغييرات التجريبية في4،المكروية5. أورجانويدس سرطان البروستاتا يمكن زراعتها كجزء من نهج الطب الدقة لنمذجة مرض المريض واستجابة للعلاجات10.
هذا البروتوكول قد جمعت من البروتوكولات القائمة التي تستخدم مختلف أنواع الخلايا، ولكن قد تم تحسين هنا للاستخدام في خلايا البروستاتا البشرية الأولية. أنها تكمل البروتوكولات التي حددها ساورز، كليفيرس، وشين5،6 التي تصف النمو، باساجينج، تصوير مشرق الميدان، نعد، وعزل الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي أورجانويدس البشرية والماوس البروستاتا. يتم تعديل البروتوكول كل جبل من ماهي et al. 11، الذي يستخدم أورجانويدس الظهارية المعوية، ويصف العيش التصوير والمجمدة والبارافين التضمين. بورتن et al. 12 وصف التحليل للثدي والقولون وسرطان القولون والمستقيم أورجانويد مورفولوجيا من تصوير مشرق الميدان. بالإضافة إلى ذلك، ريتشاردز وآخرون. 13 يستخدم أسلوب لتقييم مورفولوجك أورجانويدس البروستاتا. وأخيراً، هو جين تاو et al. 14 وصف أسلوب المنضمة البروستاتا أورجانويدس لشريحة دائرة بين ليلة وضحاها قبل تلطيخ إيممونوفلوريسسينت لمراقبة الخلايا المفردة وتشتت من المجالات من أجل تحليل التدفق الخلوي.
والهدف من هذا البروتوكول إثبات بتفصيل كاف هذه الأساليب تحديا تقنيا كبروتوكول واحد، بما في ذلك الخلية البذر؛ وسائل الإعلام ومصفوفة جل الصيانة؛ مجموعة من الخلايا للتدفق الخلوي؛ الجيش الملكي النيبالي، والحمض النووي، واستخراج البروتين؛ تقييم السمات من تحليل مشرق حقل z-المكدس؛ التضمين، تجهيز وتقطيع لتلطيخ نسيجية؛ وتركيب كل لفحوصات مسبار الفلورة أو الفلورسنت. سوف تختلف أهميتها البيولوجية وتفسير هذه النهاية مختلفة بين التصميم التجريبي والأجسام المضادة المستخدمة للتحليل. من خلال الاستفادة من هذا البروتوكول، ينبغي أن يشعر المستخدمين استعداد لإعداد تجربة مع مجموعة من أدوات لنقاط النهاية.
وأنشئت البشرية الأولية البروستاتا (ما قبل) الخلايا الظهارية في المختبر ببروتوكول وصف بيهل15،16 ، والإبقاء على عدد محدود من المقاطع (ما يصل إلى أربعة) كما هو موضح سابقا17، ولكنها أيضا المتاحة من الموردين التجاريين. يتم نشر جميع تتمثل خالية من المصل المستندة إلى وسائل الإعلام6، على أساس كسفم13، و R-سبوندين 1-مكيفة5 وسائط الإعلام بإنتاجها بنجاح أورجانويدس. على أساس كسفم يتطلب أقل عدد من المواد المضافة، حيث يتم وصفها هنا.
الثقافة أورجانوتيبيك طريقة جديدة مثيرة لأتصدى الأنسجة مع الراحة لبيئة في المختبر . في الوقت الراهن، تنمو مختبرات أورجانويدس من أنواع عديدة من الأنسجة لمختلف نقاط النهاية. الطرق الموضحة في هذه الورقة تلخيص نقاط النهاية مفيدة، وتسليط الضوء على تقنيات جديدة لوصف الثقافات الخلية البروستاتا الأولية 3D تماما.
وهناك مجموعة متنوعة من وصفات وسائل الإعلام لزراعة الخلايا البشرية البروستاتا الأولية أورجانويدس5،،من613. بينما الجميع تحقيق نتائج مجدية وقابلة للمقارنة، وسائل الإعلام على أساس كسفم13 يستخدم المواد المضافة إلى الحد الأدنى حتى يتم وصفها هنا. بالإضافة إلى ذلك، تم نشر ورقات استخدام تركيزات متعددة لجل مصفوفة، من 10% إلى 75% للثقافة أورجانويدس البروستاتا5،،من613. لأن جل مصفوفة كاشف مكلفة، وجل مصفوفة 33% قد ثبت أن تكون كافية لزراعة طويلة الأمد (2-3 أسابيع)،13من أورجانويدس قابلة للحياة، أونكلومبيد، وهذا هو تركيز الموصى بها. ومع ذلك، يمكن أن تختلف جل المصفوفة في تركيز البروتين بين الأرقام الكثير، حتى هذا ينبغي أن تؤخذ في الاعتبار عند الطلاء. من المستحسن أيضا لشراء هلام مصفوفة بكميات كبيرة للاستخدام عبر عدة تجارب للحد من التضارب بين الكثير. وقد نشر مختبرات أخرى تنسيقات مختلفة لطلاء جل مصفوفة، مثل قطرات بدلاً من طلاء لوحة 96-جيدا جيدا5. تشكل كلا الأسلوبين أورجانويدس قابلة للحياة، ولكن بالشكل الموصوف هنا يسمح للخلايا لتكون مطلي أكثر قليلة، التي أظهرت لتشجيع توسيع نطاق الخلايا إلى أكبر أورجانويدس13. ومع ذلك، تصفيح الكثافة ينبغي أن يكون الأمثل القائم قبالة كفاءة تكوين خاصة بالمريض. هلام المصفوفة متاح في العديد من الأشكال بما في ذلك تخفيض عامل النمو، خالية من الفينول الحمراء، وعالية التركيز، إلخ. تخفيض عامل النمو ينصح بتعريف شروط الثقافة، وخالية من الفينول الأحمر المستحسن عند العمل مع الخلايا التي تعبر عن التجارة والنقل أو في التجارب التي تنطوي على التقاط صورة z-المكدس. من الأهمية بمكان إجراء أية خطوات الطلاء جل مصفوفة مع الكواشف المثلج، كمصفوفة جل يتصلب بسرعة في درجة حرارة الغرفة.
قد يؤدي التغييرات أورجانويدس نمت تحت علاجات تجريبية مختلفة للشكل، حتى تصوير مشرق حقل يستخدم على نطاق واسع لدراسة الملاحظة المورفولوجية تعمل. ومع ذلك، تسجيل وقياس المساحة أو الشكل تحد لسببين: 1) اختيار التحيز أثناء التقاط الصور و 2) تطبيق معلمة ثنائية الأبعاد مثل المجال لنموذج ثلاثي الأبعاد. استراتيجية واحدة لالتقاط الصور هو سجل حقل عشوائي وقياس عدد محدد سلفا من أورجانويدس في هذا المجال، ولكن يمكن أن يخلق ذلك التحيز أثناء التحديد، وقد لا تكون جميع أورجانويدس في الحقل المحدد في التركيز. تصوير كل جيدا الأمثل لتنسيق الميكروسكوبية 96-جيدا يلغي هذا التحيز أخذ العينات عن طريق جمع السكان أورجانويد كامل للفائدة. ومع ذلك، اعتماداً على أهداف المجهر من ناحية، قد تحتاج حقول متعددة جمعها وتجانب بغية الحصول على صورة الجامعة، حسنا. وقد وصف بعض مختبرات قياس المجال من z-طائرة واحدة12، ولكن لالتقاط جميع أورجانويدس في التركيز، من المستحسن لجمع وكومة طائرات متعددة في شركة كهرباء فرنسا-صورة واحدة13. وفي بعض الحالات، قد يتسبب غضروف في جل مصفوفة التظليل في الصورة، وأساليب تصحيح الخلفية قد تحتاج إلى تطبيق باستخدام برنامج تحليل الصور. حجم الدقيق مثالي القياس الأكثر ملائمة لحجم أورجانويد؛ ومع ذلك، هذا صعوبة الحصول على وجه التحديد، حتى مع صور z-المكدس متعددة. يمكن بسهولة حساب الأبعاد المورفولوجية الأخرى المفيدة، مثل التدوير ونسبة الحد الأقصى/الحد الأدنى، من جميع أورجانويدس في صورة هيئة كهرباء فرنسا كل بئر. معا، هذه الأساليب التغلب على أخذ العينات التحيز للتحديات وتمكين قياس البارامترات 2D من كائنات ثلاثية الأبعاد في الفضاء ثلاثي الأبعاد.
التثبيت الفورمالين وتضمين برافين أورجانويدس طريقة شائعة للحصول على الهيماتوكسيلين ويوزين (H & E)، المناعي (المدينة)، وتلطيخ (إذا كان) إيمونوفلوريسسينت للتصور والتحليل6،11، 20-بيد أن المنشورات التي وصفت هذا الأسلوب تفتقر إلى تفاصيل شاملة عن عملية الدمج. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تحديد موقع أورجانويدس داخل كتلة البارافين الصعبة. قبل وصمة بعض مختبرات أورجانويدس مع تريبان الأزرق قبل التضمين للمساعدة في الموقع أثناء تقطيع11. يتضمن الأسلوب الموصوفة هنا استخدام صبغة النسيجي لتوجه جيلبلوج أورجانويد/علم الأنسجة خلال التضمين لتعزيز كفاءة تمزيقها. شرائح ح & ه تيسير دراسة نخر ومادة نووية، وانتشار، وهكذا ينبغي أن يكون نقطة إلزامية للثقافة أورجانويد التأكد من وجود خلايا صحية في جميع أنحاء المجال. قوة الثقافة أورجانويد هو أن عينات تتكون من خليط غير متجانس من الخلايا التي تشبه أفضل في فيفو أنسجة المريض. في البروستاتا، على سبيل المثال، الخلايا القاعدية ولومينال على حد سواء موجودة في البروستاتا أورجانويدس5، بينما الخلايا التي نمت في 2D عدم التفريق لومينال8. تقييم التمايز أورجانويد، من المستحسن أن الباحثين تقييم علامات القاعدية مثل CK5 و p63 وعلامات لومينال مثل مستقبلات الاندروجين و CK88. يمكن أيضا دراسة أي البروتينات تجريبية أخرى للاهتمام باستخدام هذه التقنيات المصبوغة.
على الرغم من تمكن المقاطع FFPE التصور الخلايا المقيمين في المقصورة الداخلية عن طريق النسجية أساليب (H & E، إذا، المدينة)، الصور تنحصر في المقاطع العرضية، وقد غيرت شكل أورجانويد قبل عملية الدمج. تلوين كل-جبل تمكن أورجانويد الملون ولوحظ في عين المكان، الحفاظ على الخصائص المورفولوجية تعمل وتسمح بصور للتعريب البروتين. تركيب كل أداة تستخدم لوصمة عار عينات الأنسجة الجامعة أو الجامع والحيوان، مثل الجنين الزرد أو الماوس، وتكييفها بسهولة أورجانويدس. تعديل الأسلوب الموصوفة هنا من الإجراء التي تتملكet al. 11تفاصيل النمو الأولية وثقافة أورجانويدس الجهاز الهضمي مباشرة على شريحة دائرة لتلطيخ، ويتطلب تثبيت ثقافة الأصل كاملة. الأسلوب المبين هنا ينطوي على نقل أورجانويد واحد (أو أورجانويدس) من الفائدة إلى شريحة دائرة في الوقت لتلطيخ. وهذا يتيح اختيار أورجانويدس الفردية لتحليل كل جبل في تجربة جارية دون تثبيت ثقافة الوالدين. عند القيام بتلوين كل جبل، من الضروري تحسين بيرميبيليزيشن وفترة حضانة للأجسام الأولية والثانوية لضمان تغلغل في جميع أنحاء العينة (في أي مكان من واحد أو أكثر من أيام هو مستحسن). وبمجرد تصويرها عبر الفحص المجهري [كنفوكل]، يمكن أن تنتج اﻷداءات ثلاثية الأبعاد لتمكين التعريب بروتين محدد والتصور وحساب عدد الخلايا الملون إيجابيا في عينة. التدفق الخلوي نقطة مفيدة تحديد حجم السكان القاعدية، لومينال، أو الخلايا الجذعية5،14. للقيام بذلك، استعاد جل مصفوفة الخلايا وفصلها برفق لتلطيخ. ينبغي للمستخدمين بعناية تحديد علامات مناسبة لفصل استناداً إلى الكتابات الحالية. للخلايا الظهارية البروستاتا البشرية الأولية، CD26 و CD49f بعلامات مناسبة لومينال والقاعدية، على التوالي5،21.
وباختصار، تفاصيل هذا البروتوكول النمو البشري أورجانويد البروستاتا الأولية وجمع نقاط النهاية التجريبية. من المذكرة، يمكن تطبيق تقنية متزايدة ووصف لمجموعة متنوعة من الاختبارات الأخرى التي تستخدم عادة لخلايا ثنائية الأبعاد، مثل الفلورسنت التجارب المستندة إلى التحقيق يبحث في انتشار19والمبرمج والبقع عضية سوبسيلولار. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام أسلوب جمع وتفكك الموصوفة هنا استعدادا ل تسلسل الحمض النووي الريبي خلية واحدة18. جماعياً، وهذا يدل على إمكانية قيام مجموعة متنوعة من الرواية، النهاية عالية الدقة التي يمكن تحسين الباحثين واستكشاف في المستقبل.
The authors have nothing to disclose.
ونشكر أعضاء “اتحاد المحاكم الإسلامية بيوريسبوسيتوري”، الدكتورة كلارا فالي-ناجي، وأليكس Susma، فضلا عن أطباء، الدكتور مايكل أبيرن، ودانيال موريرا، وسيمون كريفاليرو، لتيسير اقتناء الأنسجة للثقافات الخلية الأولية. ونحن نشكر مرضى “المسالك البولية اتحاد المحاكم الإسلامية” للتبرع الأنسجة للبحوث. تم تمويل هذا العمل، في جزء منه، إدارة للدفاع البروستات سرطان البحث برنامج الصحة الفوارق فكرة جائزة PC121923 (نون) ومركز اتحاد المحاكم الإسلامية السريرية وترجمة العلوم بريدوكتورال التعليم (السريرية والعلماء متعدية برنامج PECTS) (McCray وريتشاردز) ومن معاهد الصحة الوطنية في المعهد الوطني للسرطان، ومنحة أرقام U54CA202995، U54CA202997، و U54CA203000، المعروف “شيكاغو الصحة الإنصاف التعاونية” (نون وريتشاردز). المحتوى هي المسؤولة الوحيدة عن المؤلفين ولا تمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة أو وزارة الدفاع.
Cells of interest | |||
Keratinocyte-SFM (KSFM) | ThermoFisher Scientific | 17005042 | |
Fetal Bovine Serum, charcoal stripped, USDA-approved regions (FBS) | ThermoFisher Scientific | 12676029 | |
5α-Dihydrotestosterone (DHT) | Sigma-Aldrich | D-073-1ML | |
Flat bottom, polystyrene 96-well cell culture treated plate | ThermoFisher Scientific | 161093 | |
Matrigel (matrix gel) | Corning | Various | Matrix-gel: growth Factor Reduced, Phenol-red free, etc. depending on application |
Ice Bucket | |||
Cell Culture Hood | |||
1.5 mL micro-centrifuge tubes or 15 mL conical | ThermoFisher Scientific | 05-408-130, 339650 | |
Centrifuge | |||
Dispase (neutral protease) | STEMCELL Technologies | 7923 | neutral protease |
Hanks' balanced salt solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14025076 | |
TrypLE Express (cell dissociation enzymes) | ThermoFisher Scientific | 12605036 | Cell dissociation enzymes (trypsin may also work, depending on cell type, but TrypLE is more gentle and recommended for primary cells) |
TRIzol | ThermoFisher Scientific | 15596018 | suggested RNA extraction solution |
RIPA Lysis and Extraction Buffer | ThermoFisher Scientific | 89900 | suggested protein extraction solution |
DNAzol | ThermoFisher Scientific | 10503027 | suggested DNA extraction solution |
Organoids | |||
Flat bottom, polystyrene 96-well cell culture treated plate | ThermoFisher Scientific | 161093 | |
Brightfield microscope with camera capabilities | ex. EVOS FL Auto Imaging System | ||
Photo analysis software | ex. Photoshop, CELLESTE, ImageJ, MorphoLibJ, CellProfiler | ||
Graphing software | ex. Graphpad, Excel, etc | ||
Organoids | |||
Ice pack | |||
Masking tape | |||
Pipette tips (1000 μL) | |||
Razor blade | |||
Dispase | STEMCELL Technologies | 7923 | |
Agarose | Sigma-Aldrich | A9045 | |
HistoGel (histology-gel) | ThermoFisher Scientific | HG-4000-012 | |
Pencil | |||
"Plunger" from 1 cc insulin syringe | |||
Tissue Casette | Thomas Scientific | 1202D72 | |
Container to hold fixative | |||
10% neutral buffered formalin (NBF) | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
Histology pen, xylene and EtOH-resistant | Sigma-Aldrich | Z648191-12EA | STATMARK pen |
Ethanol (histologic grade) | Fisher Scientific | A405P-4 | For fixation and graded dilutions during processing |
Xylenes | Sigma-Aldrich | 214736-1L | |
Deionized water | |||
Paraffin | Leica | various | |
Tissue processor | |||
Embedding workstation | |||
Economy Tissue Float Bath | Daigger | EF4575E XH-1001 | |
Microtome | |||
Microtome blades | Ted Pella | 27243 | |
Positively charged microscope slides | Thomas Scientific | 1158B91 | |
Laboratory Oven | ThermoFisher Scientific | PR305225G | |
Hematoxylin and Eosin Stain Kit | Vector Laboratories | H-3502 | Suggested H&E staining kit |
ABC Peroxidase Standard Staining Kit | ThermoFisher Scientific | 32020 | Suggested immunohistochemistry staining kit |
Androgen Receptor Primary Antibody (AR) | Cell Signaling Technology | 5153S | Suggested primary antibody for IHC |
FFPE, sectioned organoid sample baked on a slide | |||
Ethanol (histologic grade) | Fisher Scientific | A405P-4 | dilutions should be performed using deinoized water |
Xylenes | Sigma-Aldrich | 214736-1L | |
Deionized water (DI H2O) | |||
Antigen retrieval solution | Sigma-Aldrich, Abcam | C9999, ab93684 | |
1x Phosphate Buffered Saline – PBS | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-1L | |
Normal Horse Serum | thermoFisher Scientific | 31874 | |
Bovin Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2058 | |
Counterstain (DAPI, Hoescht) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | suggested for storage but not required |
Confocal microscope | |||
Coplin | Fisher Scientific | 19-4 | |
Staining rack | IHC World | M905-12DGY | |
Staining dish | IHC World | M900-12B | |
Decloaking chamber | Biocare Medical | DC2012 | |
Humidity chamber | Thomas Scientific | 1219D68 | |
Hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
Cytokeratin 8/18 primary antibody (CK8) | ARP American Research Products | 03-GP11 | suggested primary antibody for IF |
p63-alpha antibody (p63) | Cell Signaling Technology | 4892S | suggested primary antibody for IF |
Keratin 5 Polyclonal Antibody (CK5) | Biolegend | 905501 | suggested primary antibody for IF |
Goat anti-rabbit secondary | ThermoFisher Scientific | A21245 | suggested secondary antibody for p63 or CK5 detection (do not use at same time) |
Goat anti-guinea pig secondary | ThermoFisher Scientific | A-11075 | suggested secondary antibody for CK8 detection |
Microscope cover glass | Globe Scientific | 1414-10 | |
Anti-fade mounting media | ThermoFisher Scientific | S36972 | |
Organoids | |||
Pipette tips (1000 μL) | |||
Pipette tips (200 μL) | |||
8-well chamber slide | ThermoFisher Scientific | 154534PK | It is also possible to use a confocal dish, depends on preference of user |
Cell-Tak | Corning | CB40240 | optional adherent reagent |
1x Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
4% paraformaldehye (PFA) | Biotium | 22023 | other fixatives such as methanol or formalin can be used |
50mM NH4Cl | sigma-Aldrich | 254134 | |
Triton™ X-100 (non-ionic detergent) | sigma-Aldrich | X100-1L | |
Normal Horse Serum (NHS) | thermoFisher Scientific | 31874 | |
Bovin Serum Albumin (BSA) | sigma-Aldrich | A2058 | |
Counterstain (DAPI, Hoescht) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
Counterstain (phalloidin) | thermoFisher Scientific | A22287 | |
Sodium azide | sigma-Aldrich | S2002 | suggested for storage but not required |
Confocal microscope | |||
Cytokeratin 8/18 primary antibody (CK8) | ARP American Research Products | 03-GP11 | suggested primary antibody for IF |
p63-alpha antibody (p63) | Cell Signaling Technology | 4892S | suggested primary antibody for IF |
Keratin 5 Polyclonal Antibody (CK5) | Biolegend | 905501 | suggested primary antibody for IF |
Goat anti-rabbit secondary | ThermoFisher Scientific | A21245 | suggested secondary antibody for p63 or CK5 detection (do not use at same time) |
Goat anti-guinea pig secondary | ThermoFisher Scientific | A-11075 | suggested secondary antibody for CK8 detection |
Visikol HISTO-M | Visikol | various | optional clearing agent |
Organoids | |||
Pipette tips (1000 μL) | |||
Pipette tips (200 μL) | |||
8-well chamber slide | ThermoFisher Scientific | 154534PK | It is also possible to use a confocal dish, depends on preference of user |
Cell-Tak | Corning | CB40240 | |
1x Phosphate Buffered Saline – PBS | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
Cell assay of interest | Various | Various | Click-iT EdU Alexa Fluor proliferation assay (fluorescently-labelled EdU proliferation kit), Image-iT Lipid Peroxidation Kit, etc) and fluorescent probes/dyes (ex. HCS mitochondrial Health Kit, CellMask, LIVE/DEAD Viability assays, CellROX reagents, etc) |
Organoids | |||
Ice bucket | |||
Cell culture hood | |||
1.5 mL eppendorf tubes or 15 mL conical | |||
Microcentrifuge | |||
Dispase | STEMCELL Technologies | 7923 | |
TrypLE Express (cell dissociation enzymes) | ThermoFisher Scientific | 12605036 | Cell dissociation enzymes (trypsin may also work, depending on cell type, but TrypLE is more gentle and recommended for primary cells) |
Hanks' balanced salt solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14175079 | |
Flow Tube with Cell Strainer Snap Cap | Fisher Scientific | 08-771-23 | |
Cytokeratin 5 Antibody – FITC | Millipore Sigma | FCMAB291F | Suggested flow antibody |
Cytokeratin 8 Antibody – Alexafluor 405 | Abcam | ab210139 | Suggested flow antibody |
CD49f – Alexafluor 647 | BioLegend | 313609 | Suggested flow antibody |
CD26 – PE | BioLegend | 320576 | Suggested flow antibody |