Özet

Zelle Fraktionierung von U937 Zellen in der Abwesenheit von High-Speed-Zentrifugation

Published: January 18, 2019
doi:

Özet

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die Plasmamembran, Zytoplasma und Mitochondrien von U937 Zellen ohne den Einsatz von High-Speed-Zentrifugation zu isolieren. Diese Technik lässt sich subzelluläre Fraktionen für die anschließende Untersuchung des Proteins Lokalisierung über Immunoblotting zu reinigen.

Abstract

In diesem Protokoll zeigen wir eine Methode, subzelluläre Bruchteile von U937 Zellen ohne den Einsatz von Ultrazentrifugation oder wahllose Reinigungsmittel zu erhalten. Diese Methode nutzt hypotone Puffer, Digitonin, mechanische lyse und differentielle Zentrifugation, Zytoplasma, Mitochondrien und Plasmamembran zu isolieren. Der Prozess kann skaliert werden, um den Bedürfnissen der Forscher, ist preiswert und unkompliziert. Diese Methode ermöglicht abschätzen, Protein-Lokalisierung in Zellen ohne spezielle Zentrifugen und ohne den Einsatz von kommerziellen Kits, die teuer werden können. Wir haben erfolgreich diese Methode cytosolischen trennen, Plasmamembran und mitochondrialen Proteine in die menschliche Monocyte-Zellinie U937 verwendet.

Introduction

Zuverlässige Identifikation von Protein-Lokalisierung ist oft notwendig, bei der Prüfung, molekulare Signalwege in eukaryotischen Zellen. Methoden, subzelluläre Brüche zu erhalten sind übernommen werden Forscher zelluläre Komponenten von Interesse näher zu untersuchen.

Die Mehrzahl der bestehenden Zelle Fraktionierung Methoden fällt in der Regel in zwei große Kategorien, Waschmittel-basierte1,2 und Ultrazentrifugation basierende3,4,5, die sein kann unterscheiden sich durch Schnelligkeit, Präzision und Kosten. Waschmittel je Protokolle verlassen sich auf die Verwendung von Puffern mit zunehmender Waschmittel Stärke um verschiedene Komponenten der Zelle zu solubilisieren. Dies kann ist eine schnelle und bequeme Methode für die Verarbeitung von Proben und kostengünstig, wenn die Anzahl und Größe der Proben klein sind. Waschmittel-basierte Kits können erworben werden, um cytoplasmatischen Membran/Organellen (Gemischter Bruch) und nukleare Fraktionen aus Zellen zu isolieren. Jedoch begrenzen einige Nachteile verbunden mit diesen Kits ihre Nützlichkeit für Forscher. Sie sind entworfen, um einfach ein oder zwei Komponenten der Zelle zu isolieren, aber nicht in der Lage alle Fraktionen aus einer Probe gleichzeitig zu isolieren. Die Verwendung von Reinigungsmitteln bedeutet, dass die Plasmamembran und Membran umhüllten Organellen ebenso solubilisiert werden werden und somit voneinander getrennt werden. Eine zusätzliche Schwierigkeit ergibt sich aus der proprietären Komponenten in diesen Kits, die verhindert, dass Forscher Bedingungen für spezifische Anwendungen zu verändern. Schließlich, sie sind in der Anzahl der Nutzungen eingeschränkt und möglicherweise unerschwinglich für größere Skala Experimente. Non-Reinigungsmittel basierend Kits gibt es für die Isolation von Mitochondrien, aber sie sollen nicht die Plasmamembran zu isolieren und die Probenausbeute ist deutlich geringer als die von Dichte Zentrifugierung isoliert Protokolle6,7 .

Methoden, die Ultrazentrifugation zu nutzen, um Brüche zu erhalten sind mehr zeitaufwendig, aber oft führen zu reiner Brüche als Waschmittel-basierte Kits. Um die Plasmamembranen von Zellen zu isolieren, ohne erste Gefäss-sie (was zu Kontaminationen mit Membran Organellen) verlangt, dass sie durch eine nicht-Reinigungsmittel-Methode, gefolgt von Trennung der zellulären Komponenten über differentielle lysiert werden Zentrifugation – mit der Plasmamembran Isolation erfordern Geschwindigkeiten von 100.000 × g zu erreichen. In vielen Fällen muss Isopycnic Dichte Gradienten Zentrifugation für weitere Trennung von zellulären Brüche oder Entfernung von Verunreinigungen differentielle Zentrifugation folgt. Während diese Methoden gründlich und veränderbar sind, gehören Nachteile, Kosten, Zeitaufwand und die Notwendigkeit einer Ultrazentrifuge zur Trennung von Fraktionen und weitere Reinigung über Dichte Steigung Zentrifugierung. Die meisten High-Speed-Zentrifugen sind Kosten, die für einzelne Ermittler und sind oft geteilt, Ausrüstung an Hochschulen core unerschwinglich ist. Auf diese Weise wird Ultrazentrifugen Verfügbarkeit in diesen Situationen unerschwinglich.

In diesem Protokoll Fraktionierung demonstrieren wir die Isolation der subzellularen Brüche ohne die Verwendung von Reinigungsmitteln Gefäss- und high-Speed Zentrifugation. Diese Methode erlaubt Forschern, die Plasmamembran, Mitochondrien und cytoplasmatische Komponenten einer eukaryotischen Zelle mit minimalen Kontamination zwischen den Fraktionen zu isolieren.

Protocol

1. bereiten Sie Puffer und Reagenzien Hinweis: Siehe Tabelle 1. Lösungen von Puffer A, Lyse Puffer B, Probenpuffer und Digitonin vorzubereiten. Bereiten Sie Puffer A durch Zugabe von 8,77 g NaCl und 50 mL HEPES (1 M, pH 7,4), 900 mL entionisiertem Wasser, Anpassung Endvolumen bis 1 L mit entionisiertem Wasser.Hinweis: Endkonzentrationen sind 150 mM NaCl und 50 mM HEPES. Bereiten Sie Lyse Puffer B durch Zugabe von 20 mL HEPES (1 M, pH 7,4), 0,7…

Representative Results

Erfolgreiche Fraktionierung der undifferenzierten U9378 Zellen in Suspension angebaut wurde durchgeführt unter Verwendung des Protokolls genannten und in Abbildung 1dargestellt. Die Proben, die mit dieser Methode wurden westlichen befleckenden9 Nutzung eine nasse Übertragungsmethode auf eine Membran Polyvinylidene Fluorid (PVDF) unterzogen. Die Membran wurde anschließend mit Antikörpern gegen sondiert zytopl…

Discussion

Die Entwicklung dieses Protokolls entstand aus einer Unfähigkeit, mitochondriale trennen und Membran-Proben, mit handelsüblichen Kits für die Analyse von Protein-Lokalisierung während Necroptosis14. Die primäre Einschränkungen von vorgefertigten Kits sind ihre Unfähigkeit, auf die Bedürfnisse des einzelnen Forschers angepasst werden die Kosten pro Probe und begrenzte Anzahl von Proben können verarbeitet werden. Die hier vorgestellte Methode kann ohne den Einsatz von teuren Reagenzien und …

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Arbeit wurde unterstützt von NIH-1R15HL135675-01, Timothy J. LaRocca

Materials

Digitonin TCI Chemicals D0540 For Cytoplasm Extraction
D-Mannitol Sigma-Aldrich M4125 For Lysis buffer B
Dounce homogenizer VWR 22877-282 For Homogenization
end-over-end rotator Barnstead N/A For Cytoplasm Extraction
ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) Alfa Aesar J61721 For Lysis buffer B
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich E7889 For Lysis buffer B
GAPDH (14C10) Cell Signalling Technologies 2118 For detection of cytoplasmic fractions on western blot, dilution: 1:10000
HEPES VWR J848 For Lysis buffers A and B
KCl Sigma-Aldrich P9541 For Lysis buffer B
MgCl2 Alfa Aesar 12315 For Lysis buffer B
Na, K-ATPase a1 (D4Y7E) Cell Signalling Technologies 23565 For detection of plasma membrane fractions on western blot, dilution: 1:1000
NaCl Sigma-Aldrich 793566 For Lysis buffer A
phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) VWR M145 For Cytoplasm Extraction and Homogenization Buffer
probe sonicator Qsonica Q125-110 For Final Samples
Protease Inhibitor Cocktail, General Use VWR M221-1ML For Cytoplasm Extraction
refrigerated centrifuge Beckman-Coulter N/A
Sodium dodecyl sulfate (SDS) VWR 227 For Sample buffer
sodium orthovanadate (SOV) Sigma-Aldrich 450243 For Lysis buffers A and B
Sucrose Sigma-Aldrich S0389 For Lysis buffer B
Tris-buffered Saline (TBS) VWR 788 For Sample buffer
VDAC (D73D12) Cell Signalling Technologies 4661 For detection of mitochondrial fractions on western blot, dilution: 1:1000

Referanslar

  1. Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells. MethodsX. 2, e440-e445 (2015).
  2. Hwang, S., Han, D. K. Subcellular fractionation for identification of biomarkers: Serial detergent extraction by subcellular accessibility and solubility. Methods in Molecular Biology. 1002, 25-35 (2013).
  3. Song, Y., Hao, Y., et al. Sample preparation project for the subcellular proteome of mouse liver. Proteomics. 6 (19), 5269-5277 (2006).
  4. Lenstra, J. A., Bloemendal, H. Topography of the total protein population from cultured cells upon fractionation by chemical extractions. European Journal of Biochemistry. 135 (3), 413-423 (1983).
  5. Michelsen, U., von Hagen, J. Chapter 19 Isolation of Subcellular Organelles and Structures. Methods in Enzymology. 463 (C), 305-328 (2009).
  6. Stimpson, S. E., Coorssen, J. R., Myers, S. J. Optimal isolation of mitochondria for proteomic analyses). Analytical Biochemistry. 475, 1-3 (2015).
  7. Williamson, C. D., Wong, D. S., Bozidis, P., Zhang, A., Colberg-Poley, A. M. Isolation of Endoplasmic Reticulum, Mitochondria, and Mitochondria-Associated Membrane and Detergent Resistant Membrane Fractions from Transfected Cells and from Human Cytomegalovirus-Infected Primary Fibroblasts. Current protocols in cell biology. 68, (2015).
  8. Sundström, C., Nilsson, K. Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937). International Journal of Cancer. 17 (5), 565-577 (1976).
  9. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  10. Barber, R. D., Harmer, D. W., Coleman, R. A., Clark, B. J. GAPDH as a housekeeping gene: analysis of GAPDH mRNA expression in a panel of 72 human tissues. Physiological Genomics. 21 (3), 389-395 (2005).
  11. Hodge, T., Colombini, M. Regulation of metabolite flux through voltage-gating of VDAC channels. Journal of Membrane Biology. 157 (3), 271-279 (1997).
  12. Therien, a. G., Blostein, R. Mechanisms of sodium pump regulation. American journal of physiology. Cell physiology. 279 (3), C541-C566 (2000).
  13. Devarajan, P., Stabach, P. R., De Matteis, M. A., Morrow, J. S. Na,K-ATPase transport from endoplasmic reticulum to Golgi requires the Golgi spectrin-ankyrin G119 skeleton in Madin Darby canine kidney cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (20), 10711-10716 (1997).
  14. McCaig, W. D., Patel, P. S., et al. Hyperglycemia potentiates a shift from apoptosis to RIP1-dependent necroptosis. Cell Death Discovery. 4, 55 (2018).
  15. Simpson, R. J. Homogenization of Mammalian Tissue. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (7), (2010).

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McCaig, W. D., Deragon, M. A., Haluska Jr,, R. J., Hodges, A. L., Patel, P. S., LaRocca, T. J. Cell Fractionation of U937 Cells in the Absence of High-speed Centrifugation. J. Vis. Exp. (143), e59022, doi:10.3791/59022 (2019).

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