Mutagenesi sito-diretta per In Vitro e In Vivo esperimenti esemplificati con interazioni RNA in Escherichia Coli

DNA è spesso definito come il progetto di una cellula vivente, poiché tutte le strutture della cellula sono codificate nella sequenza del suo DNA. Replica esatta e meccanismi di riparazione del DNA garantiscono che solo molto bassi tassi di mutazioni si verificano, che è essenziale per sostenere le funzioni corrette dei geni codificati. Modifiche della sequenza del DNA possono influire sulle successive funzioni a diversi livelli a partire con il DNA (riconoscimento di fattori di trascrizione e gli enzimi di limitazione), poi RNA (base-accoppiamenti complementarità e alterazioni di struttura secondaria) e/o proteine (aminoacidi acide sostituzioni, omissioni, aggiunte o telaio-turni). Mentre molte mutazioni non influiscano significativamente funzione del gene, alcune mutazioni nel DNA possono avere implicazioni enormi. Così, la mutagenesi sito-diretta è uno strumento prezioso per studiare l’importanza dei siti specifici di DNA a tutti i livelli.

Questo protocollo descrive un approccio di mutagenesi mirata utilizzato per introdurre mutazioni specifiche. Il protocollo si basa su due diverse strategie di PCR: un passaggio 2 o un 3-passo PCR. La PCR 2-step è applicabile se la mutazione desiderata è vicino l’estremità 5′ o estremità 3′ del DNA di interesse (< 200 paia di basi (bp) dalla fine) e la PCR-step 3 è applicabile in tutti i casi.

L’approccio di PCR 2-step, 3 iniettori sono stati progettati, in cui un set di primer è progettato per amplificare il DNA di interesse (primer 1 e 3, avanti e indietro, rispettivamente) e un singolo primer è progettato per incorporare la mutazione. La mutazione introducendo primer (primer 2) dovrebbe avere un orientamento inverso se la mutazione è vicino l’estremità 5′ e un orientamento anteriore se la mutazione è vicino all’estremità 3′. Nel primo passaggio PCR, primer 1 + 2 o 2 + 3 amplifica un piccolo frammento vicino l’estremità 5′ o 3′ estremità, rispettivamente. Il prodotto PCR risultante viene quindi utilizzato come primer nel passaggio due con primer 1 o 3, con il risultato di un prodotto PCR con una mutazione nel DNA di interesse (Figura 1A).

Nella PCR 3 fasi, 4 iniettori sono stati progettati, in cui un set di primer è progettato per amplificare il DNA di interesse (primer 1 e 4, avanti e indietro, rispettivamente) e un set di primer è progettato per incorporare specifiche mutazioni con sovrapposizione di complementarità (primer, 2 e 3, invertire e inoltrare, rispettivamente). Al passo uno e due, primer 1 + 2 e 3 + 4 amplificare l’estremità 5′ e 3′. Nel passaggio 3, i prodotti PCR ottenuti da passo uno e due sono utilizzati come modelli e amplificati con i primer 1 + 4. Così, il prodotto PCR risultante è il DNA di interesse con la mutazione desiderata (Figura 1B).

Mentre il DNA mutato può essere utilizzato per qualsiasi applicazione a valle, questo protocollo viene descritto come combinare nuovamente il DNA in un vettore di clonazione. L’uso di vettori di clonazione ha diversi vantaggi come la facilità di clonazione e applicazioni sperimentali specifiche a seconda delle caratteristiche del vettore. Questa caratteristica viene spesso utilizzata per studi di interazione di RNA. Un’altra tecnica per studi di interazione di RNA è strutturale di sondaggio del RNA in complesso con un altro RNA^1,2 o proteina^3,4. Tuttavia, sondando strutturale viene eseguita solo in vitro mentre mutagenesi sito-diretta e successiva clonazione permettono per studi di interazione in vivo.

Mutagenesi sito-diretta è stato ampiamente utilizzata per studi di interazione di RNA come presentato qui. Tuttavia, il metodo chiave per quanto riguarda 2 – o 3-step PCR è applicabile a qualsiasi pezzo di DNA e così non solo limitato agli studi di RNA-interazione.

Per esemplificare la tecnica e i suoi possibili usi, caratterizzazione delle regioni importanti per la regolazione post-trascrizionale del mRNA, csgD, di Escherichia coli (Escherichia coli) è usato. In e. coli, csgD è mirato di piccolo RNA non codificanti, McaS, in collaborazione con una proteina, Hfq, di reprimere l’espressione della proteina di CsgD^2,4,5. La tecnica è utilizzata per introdurre le mutazioni nella regione di appaiamento tra csgD e McaS e per il sito di legame Hfq di CDLS. Il DNA ottenuto è quindi clonato in un vettore adatto per esperimenti successivi. Applicazioni a valle della tecnica includono gli esperimenti sia in vitro che in vivo. Per l’illustrazione, esempio 1 è caratterizzata in vivo usando un’analisi di western blot ed esempio 2 è caratterizzato in vitro utilizzando un’analisi dello spostamento di mobilità elettroforetica (EMSA). In entrambi i casi, è illustrata come mutagenesi sito-può essere utilizzata in combinazione con altre tecniche per rendere biologici conclusioni circa un gene di interesse.