体外和体内实验的位定向诱变-以大肠杆菌rna相互作用为例

dna 通常被称为活细胞的蓝图, 因为细胞的所有结构都被编码在其 dna 的序列中。精确的复制和 dna 修复机制可确保只发生极低的突变率, 这对于维持编码基因的正确功能至关重要。dna 序列的变化会影响从 dna (通过转录因子和限制性酶识别) 开始的不同层次的连续功能, 然后影响 rna (碱对互补和二级结构改变) 和/或蛋白质 (氨基)酸取代、删除、添加或框架转移)。虽然许多突变不会显著影响基因功能, 但 dna 中的一些突变可能具有巨大的意义。因此, 位定向诱变是研究各级特定 dna 位点重要性的一个有价值的工具。

该协议描述了一种用于引入特定突变的有针对性的诱变方法。该协议依赖于两种不同的 pcr 策略: 2 步或3步 pcr。如果所需的突变接近感兴趣的 dna 的 5 ‘ 末端或 3 ‘ 末端 (从末端 lt;200 碱基对 (bp)), 则适用于所有情况下的三步 pcr。

在两步 pcr 方法中, 设计了3种引物, 其中一组引物被设计用于扩增感兴趣的 dna (引物1和 3, 分别向前和向后), 一个引物被设计为包含突变。如果突变接近 5 ‘ 末端, 引入引物 (引物 2) 的突变应该有相反的方向, 如果突变接近 3 ‘ 末端, 则应该有向前方向。在 pcr 的第一个步骤中, 引物 1 + 2 或 2 + 3 分别扩增一个靠近 5 ‘ 末端或 3 ‘ 末端的小片段。然后将生成的 pcr 产物用作第二步中的引物和引物1或 3, 从而导致 pcr 产物在感兴趣的 dna 中发生突变 (图 1 a)。

在三步 pcr 中, 设计了4种引物, 其中一组引物被设计用于扩增感兴趣的 dna (引物1和 4, 分别向前和向后), 一组引物设计为包含具有重叠互补的特定突变(引物2和 3, 分别反向和正向)。在第一步和第二步中, 引物 1 + 2 和 3 + 4 放大 5 ‘ 和 3 ‘ 端。在第三步中, 从第一步和第二步产生的 pcr 产品被用作模板, 并与引物 1 + 4 一起放大。因此, 产生的 pcr 产物是所需突变的 dna (图 1 b)。

虽然突变的 dna 可用于任何下游应用, 但该协议描述了如何将 dna 重新组合为克隆载体。克隆载体的使用有几个优点, 如易于克隆和特定的实验应用取决于载体的特征。此功能通常用于 rna 相互作用研究。rna 相互作用研究的另一种技术是与另一个 rna^1、2或蛋白质^3、4对复杂的 rna^进行结构探测。然而, 结构探测只在体外进行, 而位定向诱变和随后的克隆允许在体内进行相互作用研究。

现场定向诱变已被广泛用于 rna 相互作用研究, 在此介绍。然而, 关于2步或3步 pcr 的关键方法适用于任何一片 dna, 因此不仅限于 rna 相互作用研究。

为了说明这项技术及其可能的用途, 使用了对大肠杆菌 (大肠杆菌) 的 mrna、 csgd、转录后调节重要区域的表征。在大肠杆菌中, csgd是由小的非编码 rna mcas 与蛋白质 hfq 合作, 抑制 csgd^2,4^,5的蛋白表达。该技术用于将突变引入 csgd和 mcas 之间的基对区, 以及csgd的 hfq 结合位点。然后将获得的 dna 克隆到适合后续实验的载体中。该技术的下游应用包括体内和体外实验。例如, 例子1在体内使用西方印迹法进行表征, 例子2在体外使用电泳移位分析 (emsa) 进行定性。在这两种情况下, 说明了如何将位定向诱变与其他技术结合起来, 对感兴趣的基因作出生物学结论。