蛍光活性化細胞選別により確立された精製 GABAergic または Glutamatergic ニューロンの初代細胞培養

すべての手順および動物の維持は、地方からの許可の存在下で、動物の保護に関する制度的ガイドライン、ドイツ動物福祉法および欧州評議会指令 86/609/EEC に従って行われました。権威 (LaGeSo ベルリン、T-0215/11)。 注:このプロトコルは、単一のトランスジェニックマウスまたはラット pup からの精製されたニューロンの培養物 (生後1日0〜 2) を記載する。すべての技術は、無菌条件下で実行されるべきです。すべての解決は0.2 μ m フィルターを使用して殺菌されるべきである (材料のテーブルを見なさい)。ガラスカバースリップおよび解剖用具は185° c で 3 h のために熱滅菌されるべきである。 1. ポリ L リジンをカバースリップコーティングガラス 5 mL アリコートの200μ L/mL カバースリップ (PLL) 溶液を除霜し、ガラスを調製します。この原液を20μ g/mL に希釈するには、45 mL の純射出グレードの水を加えます。フィルター-新しい 50 mL の円錐形の管に解決を殺菌しなさい。このチューブを「PLL 滅菌」としてラベル付けします。注:室温で保存された水を使用して、除霜プロセスをスピードアップします。 滅菌 PLL 溶液に100滅菌、丸形、12mm ガラスカバースリップを追加します。攪拌分、2 ~ 3 分のチューブを使用して、コーティングも確実にします。この方法でカバースリップを1時間塗ります。注:彼らは信頼性の高い培養面を提供し、24ウェル細胞培養プレートのウェルに容易に適合するように、ドイツ製の丸いガラスカバースリップ (直径 = 12 ミリメートル) が好ましいです。 40分の PLL コーティングの後、2枚のティッシュペーパーを取り、それらをフローキャビネットに平らに置きます。70% のエタノールを使用して紙を滅菌し、その後平らにしてしわを取り除き、乾燥させます。 カバースリップガラスを1時間 PLL でコーティングした後、過剰な PLL を除去し、滅菌インジェクショングレードの水を加えます。余分な PLL を除去できるように、カバースリップを 2 ~ 3 秒間静かに攪拌します。このすすぎ手順を2回繰り返します。 余分な水を除去し、その後、滅菌ティッシュペーパーにカバースリップを移します。慎重に湾曲した鉗子を使用して、各カバースリップを分離し、乾燥するために残します。注:容易に分離できないカバースリップは破棄することができる。また、分離を助けるために少量の水を添加することもできます。 乾燥したら、カバースリップを24ウェル培養プレートに移します。注:カバースリップは、解剖プロセスを開始する前に約30分 ~ 1 時間の準備をする必要があります。プレートは、必要になるまで37° c および 5% の co2 でインキュベーター内に保存することができます。 2. 海馬と皮質組織の解離 細胞培養液の調製 神経組織の解離のために、最初に解凍 40 mL アリコートの細胞培養バッファー (組成 [mM]: 116 NaCl、5.4 KCl、26 NaHCO3、1.3 いいえ2PO4、1 MgSO4· 7h2o、1 CaCl2· 2h2o、0.5 EDTA ·2Na ·2O および 25 D-グルコース、pH = 7.4)。12 mL の細胞培養緩衝液を 15 mL の円錐管に測定します。「BSA」としてラベルを付けます。異なる 15 mL チューブに 5 mL の細胞培養バッファーを測定します。「パパイン」としてラベルを付けます。37° c で15分間、両方のチューブを水浴中でインキュベートします。 フィルター-残りの細胞培養バッファーを滅菌し、「バッファー-無菌」としてラベル付けし、必要になるまで4° c で保管する。 ウシ血清アルブミン (BSA) の 120 mg を秤量し、「BSA」という標識のチューブに添加する。パパインの 7 mg を計量し、「パパイン」というラベルのチューブに追加します。両方のチューブを水浴に15分間戻す。注:パパインパウダーの転送を容易にするために計量船に少量のバッファーを追加すると便利です。 すべての粉体が溶解したら、各溶液を新鮮な 15 mL の円錐管にフィルター消毒します。チューブのパパインのために、フィルタリングされた溶液を「パパイン滅菌」としてラベル付けします。チューブ BSA の場合、滅菌 BSA 溶液を3つのチューブに分割し、それぞれに 4 mL の BSA 溶液を入れます。各チューブに「BSA-滅菌」とラベルを付け、「1」、「2」、または「3」のいずれかにします。すべてのチューブを水浴に戻し、必要になるまで37° c でインキュベートし続けます。 組織解剖のための準備 35 mm の濾紙 (材料のテーブルを参照) の1つの部分を取り、70% エタノールで殺菌しなさい;100 mm ペトリ皿の蓋をして、フローキャビネットに乾燥させておきます。 、海馬および皮質の解剖のために必要なはさみ、鉗子、メスおよびスパチュラ (材料のテーブルを参照) をレイアウトします。 2 35 mm ペトリ皿を置き、フローキャビネットの中央のアクセス可能な場所に滅菌フィルターペーパーを含む 100 mm ペトリ皿を配置する。 トランスジェニック NexCre を収集する。解剖される Ai9 および VGAT ヴィーナスマウス仔。野生型同腹仔からの蛍光仔を識別するために、適切な励起および発光フィルタ (材料の表を参照) を備えた蛍光灯を使用してください。 動物を解剖する直前に、35 mm のペトリ皿を冷やされた、無菌の細胞培養緩衝液で満たしてください。注:1つのペトリ皿は、解剖間の工具を洗浄するためのものであり、他は海馬および皮質を収集するためのものである。 組織解離 細胞培養バッファーが注がれるとすぐに、斬るは、大きく鋭いはさみを使用して生後1日 0-2 トランスジェニックマウスまたはラット pup を使用し、頭部をフローキャビネットに移すために無菌の 100 mm ペトリ皿を用いる。鉗子、はさみ、スパチュラを使用して、トランスジェニック・ pup の脳を慎重に滅菌フィルター紙に移します。 タイプ22のメスを使用して小脳を分析し、2つの半球を分離する。横方向に半球をロールバックするために、小さなスパチュラを使用してください。各半球で、皮質がフィルターペーパーと接触するように、穏やかに押し下げます。静かに海馬と皮質を明らかにするために中脳の領域を移動します。注:半球またはセルを押し下げて押しつぶされるようにするには、あまり多くの圧力をかけないように注意してください。 各半球から海馬と皮質を分離するために、メスまたはスパチュラを使用してください。この組織を、冷却細胞培養緩衝液を含む 35 mm ペトリ皿に移動させる。注:複数の動物を解剖する場合は、滅菌細胞培養バッファーを氷上の 50 mL 円錐管に保存する。それぞれの解剖の後、組織を冷却された細胞培養バッファーに切開した。 皮質-海馬組織の解剖を成功させた後、滅菌パパイン溶液を水浴からフローキャビネットに移す。3 mL パスツールのピペットを使用して、摘出した海馬および皮質を滅菌 35 mm ペトリ皿の蓋に移します。タイプ22メスの平らな部分を使用して、組織が小片になるまで、十字運動でチョップ。 少量のパパインソリューションを使用して、ペトリ皿の蓋から切り刻まれたティッシュを滅菌パパインチューブに移す。パパインチューブを水浴に戻し、37° c で25分間組織をインキュベートします。 パパインインキュベーションの間、完全な蛍光培地溶液を構成する。1 mL アリコートの B27、0.5 mL アリコートの Glutamax と 0.5 mL アリコートのペン喉頭炎を解凍します。アリコート 48.5 mL の休止状態は、50 mL の円錐形のチューブに低蛍光媒体を備えています。B27、Glutamax、ペン喉頭炎をソリューションに追加します。ソリューションをよく振ってから、フィルター消毒を行い、「休止状態の完全なメディア」 (日付とイニシャルを含む) としてラベルを付けます。37° c で水浴中でインキュベートします。 パパインインキュベーション後、パパインチューブと滅菌 BSA チューブをフローキャビネットに移します。1 mL パスツールピペットを使用して、パパインチューブから BSA チューブ1に皮質-海馬組織のみを除去します。注:過剰なパパインソリューションの転送を最小限に抑えるように注意してください。 細胞の解離 組織の大きな塊を破壊するために、1 mL のパスツールピペットを使用して組織を数回 triturate します。これに続いて、ファインチップパスツールピペットを用いて組織を7回 triturate。組織を30秒間放置しておくと、組織の大きな部分が堆積物になります。 30秒後、下 1 mL の溶液および組織を bsa-チューブ1から BSA チューブ2に移す。Triturate は、ファインチップパスツールピペットを使用して、BSA チューブ2を数回にわたって組織を再利用します。 からむ後、BSA-チューブ1から組織および溶液の下部1ml を再び移したが、これは BSA-チューブ3になる。Triturate は、ファインチップパスツールピペットを使用して、BSA チューブ3の組織を数回繰り返します。 からむ後、チューブ2および3からすべての溶液および組織を BSA チューブ1に移す。Triturate はさらに2-3 回、3分間 3000 x gで遠心分離します。 遠心分離中に、完全な神経基礎メディア (NBA メディア) を構成します。アリコート48.5 の NBA メディアを 50 mL の円錐形のチューブに、水浴で37° c でインキュベートします。このチューブに「NBA のみ」とラベルを付けます。さらに、B27 の1ml のアリコートを、室温で Glutamax の 0.5 mL アリコートおよび 0.5 mL アリコートのペン喉頭炎を解凍します。 遠心分離後、ペレット化した組織から上清を慎重に除去し、細胞を 2 mL の完全な培地で再懸濁させる。P1000 ピペットを使用して、組織を20回 triturate します。注:あまりにも活発に細胞をピペットにしないように注意してください。あまりにも多くの圧力が適用されると、細胞が損傷することがあります。 1 mL パスツールピペットを使用して、30μ m の細胞篩を通した細胞懸濁液をポリスチレンサンプルチューブに濾過します。注:細胞懸濁液が細胞篩を直ちに通過しない場合、流れを開始するために無菌の手袋を用いて篩の上を押す必要があるかもしれない。この重要なステップは、セルソーターの目詰まりを防止します。 選別した後にニューロンを収集するには、必要な数のポリプロピレンチューブに、ピペットで300μ l のフルメディアを使用して収集チューブを準備します。 セル懸濁液を選別するためにセルソーターに移動する準備が整いました。サンプルの希釈が必要な場合には、セル懸濁液、余分な回収チューブを取り、完全にメディアをスペアにしてください。 3. 精製 GABAergic または Glutamatergic ニューロンの細胞選別 注:選別中の細菌汚染の可能性を最小限にするために、ソーティングのサンプルチューブを 70% エタノールでソートする前に少なくとも5分間洗浄します。詳細な選別パラメータは、機器によって異なり、基本的考察は以下の通りである。 最初のセルソート中に、野生型動物からの細胞を選別して比較することによって、未標識細胞からのバックグラウンド蛍光のレベルを確立する。 ソートする蛍光セルタイプごとに、適切な励起および発光フィルタを選択します。488 nm または 531 nm の励起波長をそれぞれ使用して、金星と TdTomato タンパク質を励起します。530/40 と575/30 の発光フィルタセットを介して放出された光を検出します。 細胞のコレクションのための細胞の選別機に完全な媒体の300μ l を含んでいるポリプロピレンのコレクションの管を、加えなさい。 高純度の場合、明るい標識の蛍光セルをソートします (例えば、ソートされたセルのドット・プロットの場合は図 1bを参照してください)。 並べ替えの後、最適な結果を得られるように、選別されたセルの純度検定を実行して純度レベルを推定します。並べ替え後のセルの通常の回復率は 70 ~ 80% の間であることに注意してください。 各コレクションチューブにソートされたセルの数を書き留めます。この値は、セルソーティング装置によって与えられます。注:セルソーティングは、70μ m ノズル (70 psi シース液圧) または100μ m ノズル (20 psi シース液圧) を使用して行うことができます。 4. ソートニューロンの培養 細胞選別の後、採取した細胞を、1ml のパスツールピペットを用いて2ml の丸い底面遠心管に移します。細胞ペレットを形成するために、3000 x gで3分間遠心します。注:細胞ペレットの位置を特定するのを助けるために、配向を外側に向いている蓋のヒンジで丸い底部遠心管を形成し、これは、細胞ペレットが遠心管の背面 (すなわち、ヒンジとしての管の同じ側) 上に構成することを可能にする。 遠心分離の間に、B27、0.5 mL の Glutamax および 0.5 mL の喉頭炎を予温められた NBA メディアの 48.5 mL に追加します。ソリューションをよく振ってから、滅菌とラベルを「NBA コンプリート・メディア」 (日付とイニシャルを含む) としてフィルタリングします。必要になるまで水浴に戻ります。 遠心分離後、1 mL パスツールピペットを使用して上清を別の遠心管に転写する (細胞ペレットが乱された場合には上清を保持する)。1000細胞/μ l の細胞密度を達成するために予め温められた完全な NBA メディアの必要量で細胞ペレットを再懸濁させる。 P200 または P1000 ピペットを使用して、セルを上下にピペットで再懸濁します。 解離した細胞の存在を確認するために、4倍または10倍対物レンズを使用して、顕微鏡下で細胞溶液を確認してください。あるいは、少量の細胞溶液をカバースリップ上にピペットで載せ、顕微鏡下で確認する。多数の細胞が存在する場合、ステップ4.3 から上清を廃棄することができる。 細胞をめっきする前に、中速で2〜3秒間渦をしても細胞懸濁液を確保する。ボルテックスに続いて、10μ l の細胞懸濁液を各カバースリップの中心に迅速にピペットで当てる。細胞をピペットで戻した後、各プレートをインキュベーター (5% CO2/37 ° c) に迅速に戻り、1時間インキュベートします。注:複数の24ウェルプレートにセルを追加する場合は、プレート間のセルのボルテックスによってもセル密度を確認します。 1時間後、予温めた完全な NBA のメディアの500μ l で細胞をフィードし、インキュベーターに戻ります。注:細胞を供給する際には、細胞の離脱を避けるために、ウェルの側に優しく培地をピペットで送ることが重要です。短い実験 (< 16 日) のために、上記の密度での給餌は必要ありません。より大きい密度の細胞をめっきする場合、より頻繁な供給間隔が必要になることがある (考察を参照)。 5. Astrocyte に濃縮したグリアのサポート文化 注:グリア培養14の産生および細胞培養挿入物の使用は、以前に12に記載されている。簡単に説明すると、astrocyte 豊かなグリア培養物は、皮質-海馬組織 (髄膜を取り除いたもの) から得られる。P2 – P5) は、20μ g/mL の PLL 被覆6ウェルプレートで1週間培養されたもので、血清添加 DMEM 培地である。 精製されたニューロンおよびグリア細胞を共培養するためには、必要な数の細胞培養挿入物 (0.4 μ m の細孔の大きさ—材料の表を参照) に合流してグリア細胞を継代する。細胞を通過させるために、培養器からコンフルエントなグリア細胞を含む6ウェルプレートを、2ウェルを洗浄し、2回、2 mL のプレ加温 (37 ° c) リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) を用いた。 PBS 溶液を吸引し、P1000 ピペットを使用して、予加温された (37 ° c) トリプシンを 1 mL 追加します (1: 250)/EDTA (0.25%/0.02%)それぞれの井戸へのソリューション。 6ウェルプレートをインキュベーターに戻し、細胞剥離のために 2 ~ 3 分ごとに確認します。 有意な細胞剥離が発生したら、細胞および細胞溶液を微細チップパスツールピペットを使用して穏やかに上下にピペットで、個々の細胞のさらなる剥離および分離を助ける。 セル溶液を 15 mL の円錐管に移し、3000 x gで3分間遠心分離します。 P1000 ピペットを 5 mL の予温めた (37 ° c) NBA の完全なメディアで再懸濁し、細胞ペレットが溶液になるまで静かにピペットで動かします。 Haemocytometer または自動セルカウンタを使用してセル数を実行します。注:培養7日後、約 750000-1000000 の細胞は、6ウェルプレートの各ウェルから収穫することができます。 プレート4万は、グリア細胞を各細胞培養液に500μ l 液滴 (80 細胞/μ l) で挿入する。 細胞を1時間接着させた後、滅菌鉗子を使用して、グリアで覆われた細胞培養液を、精製したニューロンを含む24ウェルプレートに移します。余分なメディアを細胞培養液の表面から取り除きます (約300μ l)。注:気泡が細胞培養インサートの下に閉じ込められることがよくあるので、これらの気泡を取り除くためにインサートを静かに傾ける必要があるかもしれません。より多くのグリア細胞が細胞培養挿入物に添加される場合、さらなる洗浄および遠心分離ステップは、過剰なトリプシンを除去することを必要とし得るが、これは細胞生存に有害であり得る。