Primary Cell Culture of Purified GABAergic or Glutamatergic Neurons Established through Fluorescence-activated Cell Sorting

Paul Turko; Keenan Groberman; Toralf Kaiser; Yuchio Yanagawa; Imre Vida

doi:10.3791/58974

JoVE Journal > Neuroscience

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Nörobilim

התא הראשי תרבות של מטוהרים GABAergic או Glutamatergic נוירונים הוקמה באמצעות מיון תאים פלואורסצנטית מופעל

Published: June 06, 2019

doi:

10.3791/58974

Paul Turko¹, Keenan Groberman¹, Toralf Kaiser², Yuchio Yanagawa³, Imre Vida¹

¹Institut für Integrative Neuroanatomie, Charité,Universitätsmedizin Berlin, ²Department for Cytometry and Cellsorting, German Rheumatism Research Center,Leibniz Institute, ³Departments of Genetic and Behavioral Neuroscience,Graduate School of Medicine, Gunma University

Özet

פרוטוקול זה מתאר מיון תא שיטה מבוססת על טיהור ותרבות של GABAergic פלורסנט או glutamatergic נוירונים מקליפת המוח וההיפוקמפוס של עכברים לאחר הלידה או חולדות.

Abstract

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא ליצור תרבויות נוירואליות מטוהרים נגזר משני GABAergic או glutamatergic נוירונים. נוירונים מטוהרים יכולים להיות מתורבתים במדיה מוגדרת במשך 16 ימים מחוץ למבחנה והם מוזמנים לניתוח כלשהו שבוצע בדרך כלל על תרבויות שאינן מוצדות, ובכלל זה אלקטרופיזיולוגיה, ניתוח מורפולוגיים והישרדות. היתרון העיקרי של תרבויות אלה הוא כי סוגי תאים ספציפיים ניתן ללמוד באופן סלקטיבי בהעדר השפעות חיצוניות מורכבות, כגון אלה הנובעים מתאי גליה או סוגי נוירונים אחרים. בעת תכנון ניסויים עם תאים מטוהרים, עם זאת, חשוב לציין כי הנוירונים תלויים בחוזקה על מדיה ממוזג של גליה לצמיחה שלהם הישרדות. בנוסף, הנוירונים glutamatergic עוד תלוי בגורמים glia-המופרשים להקמת שידור סינפטית. לפיכך, אנו מתארים גם שיטה עבור נוירונים co-culturing ותאי גליה בסידור ללא מגע. באמצעות שיטות אלה, זיהינו הבדלים משמעותיים בין הפיתוח של הרשתות הנוירורגיות וglutamatergic. כך, לימוד תרבויות של נוירונים מטוהרים יש פוטנציאל גדול לקידום ההבנה שלנו איך מערכת העצבים מפתחת ופונקציות. יתר על כן, תרבויות מטוהרים עשוי להיות שימושי עבור חקירת הפעולה הישירה של סוכני תרופתי, גורמי גדילה או לחקור את ההשלכות של מניפולציות גנטיות על סוגי תאים ספציפיים. ככל שחיות יותר ויותר טרנסגניים הופכות לזמינות, מתייג סוגים נוספים של סוגי תאים מסוימים, אנו מצפים שהפרוטוקולים המתוארים כאן יגדלו בישימות ובפוטנציאל שלהם.

Introduction

מיון התא הוא כלי רב עוצמה לבידוד של תאים חיים מעניינים מתערובת הטרוגנית של תאים. ניתן למיין תאים בהתאם לקריטריוני גודל וצורה, כמו גם לביטוי של סמני פלורסנט¹^,². לעתים קרובות, fluorophore-נוגדנים מצופנים משמשים כדי לסמן סוגי תאים שונים על-ידי פילוח של משטח ספציפי לתא אנטיגנים³^,⁴. לחילופין, בעלי חיים טרנסגניים או מערכות שילוח נגיפי הותכננו לבטא fluorophores תחת היזמים ספציפיים לתא⁵^,⁶. מבחינה היסטורית, התפתחות הכלים הטרנסגניים ובעלי החיים הייתה יקרה וצורכת זמן רב. לאחרונה, הפחתת עלויות ופחות קשיים טכניים הובילו לעלייה דרמטית במספר שורות הכתב הזמינות. כאשר הזמינות של כלים טרנסגניים ובעלי חיים עיתונאי ממשיכה לצמוח, כך גם התועלת והישימות של שיטות מיון של תאים פלואורסצנטית מבוססי.

הדגמנו לאחרונה כי התא מיון מבעלי חיים טרנסגניים ניתן להחיל באופן שגרתי כדי לטהר את הנוירונים העיקריים לקראת תרבות התא⁷. על-ידי מיון תאים מחולדות או עכברים, היינו מסוגלים לבודד את הנוירונים התרבות פלורסנט, אשר לבטא העיתונאי פלורסנט חלבונים במיוחד ב gabaergic או glutamatergic נוירונים⁶^,⁸^,⁹. על ידי לימוד אלה תרבויות נוירואליות מטוהרים, היינו מסוגלים לזהות הבדל חשוב בדרך GABAergic ו glutamatergic נוירונים תלוי בגורמים מופרש גליה להקמת שידור סינפטית⁷. בנוסף, על ידי co-culturing תאים גליאל עם נוירונים מטוהרים, היינו מסוגלים להאריך על תצפיות קודמות הממחיש את התפקיד הקריטי כי תאי גליה לשחק בצמיחה והישרדות של נוירונים¹⁰^,¹¹. כך, באמצעות שילוב של מיון התא ותרבות התא, הצלחנו ללמוד לא רק את הפיתוח של סוגי נוירונים ספציפיים בבידוד, אבל היו מסוגלים לחקור את ההשפעה של תאי גליה על תפקידם.

אנו מציגים כאן פרוטוקול לטיהור ותרבות של GABAergic ו glutamatergic נוירונים מן הקליפה ההיפוקמפוס של עכברים הטרנסגניים או חולדות. אנו מציגים גם שיטה עבור שיתוף התרבות ללא קשר של נוירונים מטוהרים ותאי גליה, המותאם מגייסלר ואח ‘¹². כדי ליצור תרבויות GABAergic מטוהרים, יש לנו מיון נוירונים פלורסנט מ VGAT-ונוס-חולדות Wistar⁸ או vgat-ונוס עכברים¹³, אשר באופן סלקטיבי לבטא גרסה צהובה משופרת של חלבון פלורסנט (ונוס) ב-> 95% של . נוירונים. כדי ליצור תרבויות glutamatergic מטוהרים, יש לנו מיון נוירונים פלורסנט מ NexCre מיין; Ai9 עכברים⁶^,⁹, אשר לבטא tdtomato בנוירונים glutamatergic הקליפת העצם. הליך מיון ותרבות כולו ניתן לבצע בתוך 3-4 h והוא יכול לשמש כדי לייצר מאות תרבויות שכפול מתאים אלקטרופיזיולוגיה, מורפולוגית וניתוח הישרדות תאים. השיטה היא פשוטה, הניתנת להפקה ויכולה לייצר תרבויות נוירואליות מטוהרים, כי הם גדולים מ 97% טהור עבור סוג התא של עניין.

Protocol

כל ההליכים ותחזוקת בעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיים, חוק רווחה בעלי חיים גרמני והוראת המועצה האירופית 86/609/EEC לגבי הגנה על בעלי חיים, בנוכחות הרשאות מקומיות הרשויות (LaGeSo ברלין, T-0215/11). הערה: פרוטוקול זה מתאר את התרבות של נוירונים מטוהרים מעכבר הטרנסגניים יחיד או גור עכברוש (יום הלידה 0 – 2). יש לבצע את כל הטכניקות בתנאים סטריליים. כל הפתרונות צריך להיות מעוקר באמצעות מסנן 0.2 יקרומטר (ראה טבלת חומרים). שמיכות זכוכית וכלים לחיתוך צריך להיות מעוקר חום עבור 3 h ב 185 ° c. 1. כיסוי זכוכית ציפוי עם פולי-L-ליזין הכנת שמיכות זכוכית על ידי הפשרה 5 mL סדרת מחלקים של 200 μg/ml פולי-L-ליזין (pll) פתרון. לדלל את הפתרון מניות זה 20 μg/mL על ידי הוספת 45 mL של מים טהור כיתה הזרקה. סינון-לחטא את הפתרון לתוך צינורית 50 mL חדשה. סמן צינור זה כמו “מעקר PLL”.הערה: להשתמש במים המאוחסנים בטמפרטורת החדר כדי להאיץ את תהליך הפשרה. הוסף 100 סטרילי, עגול, 12 מ”מ שמיכות זכוכית לפתרון PLL סטרילי. מתפרעים הצינור כל 5 – 10 דקות, עבור 2 – 3 דקות, כדי להבטיח ציפוי אפילו. . בסדר.הערה: שמיכות זכוכית עגולות מתוצרת גרמניה (קוטר = 12 מ”מ) הינן מועדפות, כאשר הן מספקות משטח תרבותי אמין ומתאימות בקלות לתוך הבארות של לוחית התרבות הסלולרית הפתוחה 24 שעות ביממה. לאחר 40 דקות של ציפוי PLL, לקחת 2 פיסות נייר טישו ולהניח אותם שטוח בארון הזרימה. לחטא את הנייר באמצעות 70% אתנול, לאחר מכן לשטח כדי להסיר קמטים ולעזוב להתייבש. לאחר ציפוי זכוכית שמיכות עבור 1 h עם PLL, להסיר את הפתרון PLL עודף ולהוסיף סטרילי הזרקה מים כיתה. בעדינות מתפרעים את שמיכות עבור 2 – 3 s כדי לאפשר הסרה של העודפים PLL. חזור על שלב זה שטיפה 2 פעמים נוספות. הסירו את המים העודפים ולאחר מכן העבירו את הכיסויים לנייר הטישו הסטרילי. בזהירות להפריד כל שמיכות באמצעות מלקחיים מעוקל ולעזוב להתייבש.הערה: שוברי כיסוי שאינם נפרדים בקלות ניתנים למחיקה. לחילופין, ניתן להוסיף כמות קטנה של מים כדי לסייע להפרדה. לאחר ייבוש, להעביר את הכיסויים לצלחת התרבות 24 היטב.הערה: כיסוי צריך להיות מוכן כ 30 דקות – 1 h לפני תחילת תהליך הניתוח. ניתן לאחסן צלחות בחממה ב-37 ° c ו-5% CO2 עד לצורך. 2. דיסוציאציה של היפוקמאל ורקמה קורטיקלית הכנת פתרונות לתרבות התאים עבור הדיסוציאציה של רקמות עצביות, ראשית להפשיר a 40 mL מאגר של תרבות התא (הרכב [ב mM]: 116 הנאל, 5.4 KCl, 26 נחקו3, 1.3 נה2PO4, 1 mgso4· 7h2o, 1 קאסול2· 2h2o, 0.5 edta · 2Na · 2Na2O ו -25 D-גלוקוז, pH = 7.4). מדידת 12 מ ל של מאגר תרבות התא ל 15 מ”ל צינור חרוט; תווית כ-“BSA”. מדידת 5 מ ל של מאגר תרבות התא כדי שפופרת 15 mL שונים; תווית כ-“papain”. מודטה שתי הצינורות באמבט מים 15 דקות ב 37 ° c. סינון-חטא את המאגר הנותר של תרבות התא, תווית כ-“סטרילי מאגר” ואחסן ב-4 ° צ’ עד הצורך. שוקלים 120 מ”ג של סרום אלבומין (BSA) ומוסיפים לצינור המסומן” BSA “. שוקלים 7 מ”ג של פפאין ולהוסיף את הצינור המסומן” פפאין “. להחזיר את שני הצינורות לאמבט מים 15 דקות.הערה: זה מועיל להוסיף כמות קטנה של מאגר לסירה שוקלים כדי להקל על העברה של אבקת פפאין. לאחר כל האבקות יש התפרקה, מסננים לעקר כל פתרון לצינור חדש 15 מ ל חרוט. עבור papain צינור, תווית את הפתרון המסונן כמו “papain-סטרילי”. עבור BSA צינור, לחלק את הפתרון BSA סטרילי ל 3 צינורות, כל אחד המכיל 4 מ ל של פתרון BSA. סמן כל צינור כ-“BSA-סטרילי” ו-“1”, “2” או “3”. החזר את כל הצינורות בחזרה לאמבט מים ולהמשיך הדגירה ב 37 ° צ’ עד הנדרש. הכנה לניתוח רקמות קח חתיכה אחת של נייר מסנן 35 מ”מ (ראה טבלת חומרים) ולעקר עם 70% אתנול; משאירים להתייבש במכסה של צלחת פטרי ב100 מ”מ, בתוך ארון זרימה. כבו את המספריים, מלקחיים, אזמל ומרית (ראו טבלת חומרים) הנדרש לניתוח ההיפוקמפוס וקליפת המוח. מניחים 2 35 מ”מ מנות פטרי וצלחת פטרי 100 מ”מ המכילה נייר סינון סטרילי במיקום נגיש במרכז של ארון הזרימה. אסוף את היצורים הטרנסגניים; Ai9 ו VGAT ונוס כלבלבים העכבר שיש לגזור. השתמש מנורה פלואורסצנטית עם עירור מתאים ומסנני פליטה (ראה טבלת חומרים) כדי להפלות גורים פלורסנט מן הסוג פראי החברים. מיד לפני מבתר בעלי חיים, למלא כל 35 מ”מ צלחת פטרי עם קירור, סטרילי תרבות התא מאגר.הערה: צלחת פטרי אחת היא לנקות את הכלים בין הניתוח, והשני הוא לאיסוף ההיפוקמפוס והקליפה. ניתוח רקמות ברגע שנוצר מאגר תרבות התא, ערוף את ראשו של יום אחרי הלידה 0 – 2 שימוש בעכבר או גור חולדה באמצעות מספריים גדולים, חדים ולהשתמש בצלחת פטרי 100 mm סטרילי להעביר את הראש לתוך הארון הזורם. השתמש מלקחיים, מספריים ומרית כדי להעביר בזהירות את המוח של הגור הטרנסגניים לנייר סינון סטרילי. השתמשו בסוג 22 אזמל כדי לנתח את המוח השני ולהפריד את 2 האונות. השתמש במרית קטנה כדי לגלגל את המיספירה. בכל חצי כיתה, לחץ בעדינות כדי שקליפת המוח תבוא במגע עם נייר הסינון. הזיזו בעדינות את אזורי המוח כדי לחשוף את ההיפוקמפוס ואת הקליפה.הערה: להיזהר לא להחיל יותר מדי לחץ כאשר לוחצים על האונות או התאים יכול להיות מרוסק. השתמש אזמל או מרית כדי להפריד את ההיפוקמפוס ואת הקליפה של כל האונה. העבר רקמת בגזור לצלחת פטרי 35 מ”מ המכיל מאגר תרבות התא מקורר.הערה: אם מבתר בעלי חיים מרובים, לאחסן מאגר תרבות התא סטרילי בשפופרת 50 mL חרוט על קרח. לאחר כל ניתוח, להעביר לגזור רקמה למאגר מקורר תרבות התא. לאחר הניתוח המוצלח של רקמות קורטיקו-היפוקמאל, העבירו את התמיסה הפעין הסטרילית מאמבט המים לארון הזרימה. השתמש בצינורות 3 מ”ל כדי להעביר את ההיפוקמפוס וקליפת המוח למכסה של צלחת פטרי 35 mm סטרילי. קוצצים את התנועה כריס לחצות, באמצעות החלק השטוח של מסוג 22 אזמל, עד הרקמה היא חתיכות קטנות. השתמש כמות קטנה של פתרון פפאין להעביר את הרקמה קצוץ מן המכסה של צלחת פטרי לצינור פפאין סטרילי. להחזיר את צינור פפאין לאמבט מים ו מודטת את הרקמה ב 37 ° c עבור 25 דקות. במהלך הדגירה פפאין, להפוך את הפתרון מלאה התקשורת הפלואורסצנטית. הפשרה 1 מ”ל סדרת מחלקים של B27, a 0.5 ml של גלוטמקס ו 0.5 ml סדרת מחלקים של עט-דלקת. מ48.5 mL של שינה מדיה בעלי זריחה נמוכה לשפופרת מ50 mL. הוסף B27, גלוטמקס ו-עט-דלקת לפתרון. טלטל את הפתרון היטב, ולאחר מכן סנן ושנה תווית כ-“שינה מדיה שלמה” (עם תאריך וראשי תיבות). מודטה ב 37 ° c באמבט מים. לאחר הדגירה פפאין, להעביר את פפאין-tube ו-bsa סטרילי-צינורות אל הארון לזרום. השתמש בפיפטה 1 mL כדי להסיר רק את רקמת ההיפוטיקו-היפוקמאל מצינור פפאין לתוך bsa-tube 1.הערה: לטפל למזער את ההעברה של הפתרון העודף פפאין. דיסוציאציה של תאים כדי לשבור את כל הגושים הגדולים של רקמות, קצוצות את הרקמה מספר פעמים באמצעות 1 mL פסטר הצינורות. לאחר מכן, קצוצות את הרקמה 7 פעמים באמצעות טיפ דק הצינורות פסטר. להשאיר את הרקמה לעמוד במשך 30 s, המאפשר פיסות גדולות של רקמות לשקעים. לאחר 30 s, להעביר את הנמוך 1 mL של הפתרון והרקמה מ-BSA-tube 1 כדי BSA-tube 2. Triturate את הרקמה BSA-tube 2 מספר פעמים באמצעות טיפ דק הצינורות פסטר. לאחר trituration, להעביר שוב את התחתון 1 mL של רקמות ותמיסת BSA-tube 1, אבל עכשיו BSA-tube 3. Triturate את הרקמה BSA-tube 3 מספר פעמים באמצעות טיפ דק הצינורות פסטר. לאחר trituration, להעביר את כל הפתרונות והרקמות מצינורות 2 ו-3 לתוך BSA-tube 1. Triturate עוד 2-3 פעמים וצנטריפוגה ב 3,000 x g עבור 3 דקות. במהלך צנטריפוגה, להפוך את מלאה עצבי בסיס מדיה (מדיה NBA). Aliquot 48.5 mL של מדיית ה-NBA כדי 50 מ ל שפופרת חרוט ו דגירה ב 37 ° c באמבט מים. סמן את הצינור “NBA בלבד”. בנוסף, להפשיר 1 מ”ל סדרת מחלקים של B27, a 0.5 מ”ל סדרת מחלקים של גלוטמקס ו 0.5 mL הסדרת מחלקים של עט-דלקת בטמפרטורת החדר. לאחר צנטריפוגה, להסיר בזהירות את supernatant מן הרקמה הפלטד ולהשעות מחדש את התאים 2 מ ל של מדיה מלאה. השתמש בפיפטה P1000 כדי להפעיל את הרקמה למעלה ולמטה 20 פעמים.הערה: לדאוג לא לפיפטה את התאים נמרצות מדי. אם מוחל יותר מדי לחץ, התאים עלולים להינזק. השתמש בפיפטה 1 mL כדי לסנן את ההשעיה התא דרך מסננת תא 30 יקרומטר לתוך צינור לדוגמה פוליסטירן.הערה: אם ההשעיה התא אינו עובר מיד דרך מסננת התא, ייתכן שיהיה צורך ללחוץ על גבי המכתש עם כפפה סטרילית כדי להתחיל את הזרימה. צעד חשוב זה מונע סתימה של סדרן התא. עבור איסוף נוירונים לאחר מיון, להכין צינורות איסוף ידי pipetting 300 μL של מדיה מלאה למספר הנדרש של צינורות פוליפרופילן. ההשעיה התא הוא עכשיו מוכן להילקח סדרן התא למיון. קח את ההשעיה התא, שפופרות אוסף נוסף ומדיה מלאה רזרבי במקרה דילול המדגם נדרש. 3. תא מיון מטוהרים GABAergic או Glutamatergic נוירונים הערה: כדי למזער את הסיכוי של זיהום חיידקי במהלך מיון לשטוף את אבובים לדוגמה של הסדרן עם 70% אתנול עבור לפחות 5 דקות לפני מיון. פרמטרי מיון מפורטים משתנים בין המכשירים, שיקולים יסודיים הם כדלקמן. במהלך מיון התא הראשון, ליצור רמות של זריחה ברקע מתאים ללא תווית על ידי מיון והשוואת תאים מחיה סוג פראי. עבור כל סוג תא פלורסנט להיות ממוין, בחר את עירור המתאים ומסנני פליטה. לרגש ונוס וחלבונים TdTomato באמצעות 488 ננומטר או 531 אורכי גל עירור ננומטר, בהתאמה. זיהוי האור הנפלט באמצעות 530/40 ו 575/30 ערכות מסנני פליטה, בהתאמה. הוסף צינורות אוסף פוליפרופילן, המכיל 300 μL של מדיה מלאה, כדי סדרן התא עבור אוסף התא. לטוהר גבוה, מיין את תאי הפלורסנט המסומנים בבהירות (ראה איור 1B לדוגמה, חלקות של תאים ממוינים). לאחר המיון, לקבלת תוצאות אופטימליות, בצע בדיקת טוהר של התאים הממוינים כדי להעריך את רמות הטוהר. שימו לב שקצב ההתאוששות האופייני של תאים אחרי המיון הוא בין 70 ל-80%. שים לב למספר התאים הממוינים בכל צינור גבייה. ערך זה ניתן על ידי מכשיר מיון התא.הערה: מיון התא ניתן לבצע באמצעות זרבובית 70 יקרומטר (70 psi לחץ נוזל מעטפת) או הצינור 100 יקרומטר (20 מעטפת psi לחץ נוזל). 4. culturing של נוירונים מיון לאחר מיון התא, להעביר תאים שנאספו 2 mL בסיבוב התחתון צינורות הצנטריפוגה, באמצעות 1 mL פסטר הפיפטה. צנטריפוגה את התאים ב 3,000 x g עבור 3 דקות כדי ליצור גלולה תא.הערה: כדי לעזור לזהות את המיקום של הגלולה תא, להתמצא את צינורות הצנטריפוגה העגול התחתון עם ציר של המכסה הפונה כלפי חוץ, אשר מאפשר את הגלולה התא לטופס על גב הצינור צנטריפוגה (כלומר, באותו צד של הצינור כמו הציר). במהלך צנטריפוגה, להוסיף 1 מ ל של B27, 0.5 mL של גלוטמקס ו 0.5 mL של עט-דלקת ל 48.5 mL של מדיה טרום מחומם לפני השימוש ב-NBA. טלטל את הפתרון היטב, ולאחר מכן סנן עיקור ותווית כמו “מדיה להשלים ב-NBA” (עם תאריך וראשי תיבות). חזרו לאמבט מים עד הצורך. לאחר צנטריפוגה, השתמש בצינורות 1 מ”ל כדי להעביר את הסופרנטאנט לצינור צנטריפוגה שונה (לשמור על המקרה של הגלולה הסלולרית היתה מופרעת). מחדש להשעות את הגלולה התא בסכום הנדרש של טרום התקשורת המלאה של ה-NBA כדי להשיג צפיפות תא של 1,000 תאים/μL. Re-להשעות את התאים על ידי ליטוף למעלה ולמטה עם P200 או P1000 הצינורות. כדי לאשר את הנוכחות של תאים שאינם מותתים, בדוק את פתרון התא תחת מיקרוסקופ, באמצעות עדשה 4x או 10x אובייקטיבי. לחילופין, פיפטה כמות קטנה של תמיסת תאים על שמיכות ולבדוק מתחת למיקרוסקופ. אם קיימים מספר גדול של תאים, ניתן למחוק את הסופרנטאנט משלב 4.3. לפני ציפוי התאים, מערבולת על מהירות בינונית עבור 2 – 3 s כדי להבטיח השעיית תא אפילו. בעקבות vortexing, במהירות פיפטה 10 μL של התא הבולם למרכז של כל שמיכות. לאחר ליטוף התאים, להחזיר במהירות כל צלחת לחממה (5% CO2/37 ° c) ו הדגירה עבור 1 h.הערה: אם הוספת תאים ללוחות מרובים של 24 שעות, יש לוודא שאפילו צפיפויות תאים באמצעות התאים הורתוניים בין לוחות. אחרי 1 h, להאכיל את התאים עם 500 μL של מדיית ה-NBA להשלים מראש ולחזור לחממה.הערה: בעת הזנת התאים, חשוב לפיפטה את התקשורת בעדינות במורד הצד של הבאר כדי למנוע ניתוק תאים. עבור ניסויים קצרים (< 16 ימים), האכלה בצפיפות הנ ל אינה הכרחית. בעת ציפוי של צפיפות גבוהה יותר של תאים, ניתן יהיה לדרוש מרווחי הזנה תכופים יותר (ראה דיון). 5. אסטרוציט מועשר בתרביות תמיכה גליאל הערה: הייצור של תרבויות גליה14 והשימוש בתוספות תרבות תאים תואר בעבר12. בקצרה, האסטרוציט מועשר בתרבויות גליה נגזרות של רקמת היפוקמאל (עם הסרת קרום המוח; P2 – P5), אשר היו מתורבתים לשבוע אחד על 20 μg/mL PLL-מצופה בצלחות 6-טוב, בסרום שיושלם DMEM מדיה. כדי שיתוף התרבות מטוהרים נוירונים ותאי גליה, מעבר תאים גליה שוטפת למספר הנדרש של תרבית תאים מוסיף (0.4 יקרומטר הנקבוביות גודל — ראה טבלת חומרים). כדי לעבור את התאים, להסיר צלחת 6-היטב המכיל תאים גליה שוטפת מתוך החממה ולשטוף 2 בארות, 2 פעמים, עם 2 מ ל של מחומם מראש (37 ° c) פוספט מלוחים באגירה (PBS). מP1000 את פתרון ה-PBS ומשתמשים בפיפטה להוסיף 1 מ ל של טריפסין מחומם (37 ° c) (1:250)/edta (0.25%/0.02%) פתרון לכל באר. להחזיר את הצלחת 6-היטב לחממה ולבדוק כל 2 – 3 דקות עבור התנתקות התא. לאחר ניתוק תא משמעותי אירע, פיפטה את התאים ואת פתרון התאים בעדינות למעלה ולמטה באמצעות טיפ דק פסטר הפיפטה, כדי לסייע לניתוק נוסף והפרדה של תאים בודדים. העבר את פתרון התא ל 15 מ”ל שפופרת חרוטי ו צנטריפוגה ב 3,000 x g עבור 3 דקות. מחדש להשעות את התאים באמצעות מP1000 בתוך 5 מ ל של טרום מחומם (37 ° c) התקשורת המלאה של ה-NBA על ידי ליטוף בעדינות למעלה ולמטה עד הגלולה התא הוא בפתרון. בצע ספירת תאים באמצעות המוגלובין או מונה תאים אוטומטי.הערה: לאחר 7 ימים בתרבות, כ 750000-1000000 תאים ניתן לקצור מכל באר של 6-היטב צלחת. לוח 40,000 גליה תאים לכל תרבות תא להוסיף ב-500 μl) droplet (80 תאים/μl). לאחר המאפשר לתאים לדבוק 1 h, השתמש מלקחיים סטרילי להעביר מכוסה glial תרבות התא מוסיף לצלחות 24-היטב המכיל נוירונים מטוהרים. הסרת מדיה עודפת מהמשטח של מוסיף תרבות התא (כ-300 μL).הערה: כמו בועות האוויר יכול בדרך כלל להיות לכוד מתחת מוסיף תרבות התא, ייתכן שיהיה צורך להטות בעדינות את התוספות להוציא אלה בועות. אם התאים גליה יותר נוספים להוסיף תרבות התא, שטיפת כביסה ושלבי צנטריפוגה עשוי להידרש כדי להסיר טריפסין עודף, אשר יכול להיות מזיק להישרדות התאים.

Representative Results

הדיסוציאציה ומיון התא של נוירונים פלורסנט מפני העכבר הטרנסגניים או העכברוש cortico-היפוקמאל רקמות ניתן לבצע בערך 3 – 4 h. התוצאה היא אוכלוסיה של נוירונים טהורים מאוד הניאון, אשר ניתן לגדל בתרבות במשך 16 ימים. כדי ליצור תרבויות מטוהרים, בעלי חיים הטרנסגניים זוהו לראשונה באמצעות מנורת פלורסנט עם ערכות סינון המתאים (דוגמאות של ונוס הפלואורסצנטי VGAT ו-NexCre ונים; Ai9 גורי העכבר מוצגים באיור 1A). בעקבות הזיהוי של בעלי חיים טרנסגניים, לגזור רקמה היה הנתק, ואת הנוירונים הניאון החזק ביותר היו ממוינים כדי לייצר אוכלוסיית תאים מטוהרים. דוגמה מגרשים בעוצמה פלואורסצנטית נקודה עבור NexCre; Ai9 ו VGAT ונוס נוירונים העכבר, המתקבלים במהלך FACS, מוצגים באיור 1B. כאשר אופטימיזציה, ניתן לקצור בין 500,000 ו 800,000 תאים מן הקליפה ואת ההיפוקמפוס של הפרט P0-2 NexCre. Ai9 או העכברים של ונוס VGAT. תאים ניתן למיין במהירות כלפי מעלה של 600 אירועים/s. הערכות של טוהר התא בוצעו באמצעות DAPI כסמן גרעיני (איור 1C). על ידי מיון תאים חיוביים מאוד, טוהר של יותר מ 97% ניתן להשיג באופן שגרתי7. בעקבות מיון מוצלח, נוירונים מצופה צריך להופיע סביב הצורה, יש ממברנה חלקה יש לראות נבט neurites לאחר כ 1 h ב מבחנה (איור 2A, B). על ידי 7 ימים של מבחנה, למרות כמה מוות תאים עשוי להיות גלוי, תאים קיימא צריך להיות נוכח בכל תנאי התרבות (איור 2C, D). בגיל 12-16 ימים בתחום החוץ, באמצעות הקלטות מהדק-הדבקת תאים וביולוציטין מילוי15, ניתן לחקור את ההתפתחות האלקטרולוגית והאלקטרו-פיזיולוגית של הנוירונים המטוהרים (איור 3). ניתוח של תרבויות מטוהרים חושף כי הן הנוירונים glutamatergic ו-gabaergic הצליחו להאריך אקסונים ו דנדריטים מגופם תאים (איור 3a, B) ולשמור על היכולת ליצור פוטנציאל פעולה בתגובה suprathreshold הקיטוב זריקות הנוכחי (איור 3C, D). בעיקר, עם זאת, בעקבות טיהור, רק הנוירונים GABAergic שהתקבלו כמויות משמעותיות של שידור סינפטית ספונטנית, ואת הנוירונים glutamatergic לקבל הילוכים הסינפטית מעט מאוד בהעדר תאי גליה (איור 3E , F) 7. לאחר מכן כפי שדווחו בעבר, תאים בתרבויות מטוהרים נוטים לשרוד גרוע יותר מאשר אלה בתרבויות שאינן ממוינות ויש להם דנדריטים קטנים באופן משמעותי ו אקסונים7. כדי להתגבר על החסרונות הללו, יש לנו שיטות מותאם ומיושם לתמיכה בפיתוח של תרבויות מטוהרים עם תאים גליה12,14. הרכב הסלולר של תרבויות התמיכה גליה שלנו (DIV7) מוצג באיור 4a. התרבויות הללו הכילו חלבון חומצי בעיקר מסוג גליה fibrillary (gfap) האסטרוציטים חיוביות, אבל גם הכילו כמה מקבץ של מולקולה בידול (CD11b) מיקרוגליה חיוביים וחלבון בסיסי המיאלין (mbp) oligodendrocytes הפוך חיובית. לאחר DIV 7, תאים אלה יכולים להיות מיושנים לתוך מוסיף תרבות התא כדי לספק תמיכה ללא מגע של נוירונים מטוהרים (איור 4B, C). ניתוח של glia-נוירונים שיתוף תרבויות מגלה כי כ 40,000 התאים גליה היו מספיקים כדי לשפר את ההישרדות לטווח ארוך וצמיחה של שני glutamatergic מטוהרים ו gabaergic נוירונים (איור 4d, E)7. יתר על כן, ניתוח אלקטרולוגי מגלה כי הנוירונים glutamatergic, co-תרבותי עם תאי גליה, היו פעילים מאוד והיה מוגבר מאוד פעילות הרשת (אחוז של גליה נתמך glutamatergic הנוירונים יורה התפרצויות של פעולה פוטנציאל: 62%; n = 28; איור 4F , G). תמיכה glial ולכן חשוב לא רק לקידום הצמיחה העצב והישרדות, אלא גם לקידום שידור סינפטית והקמת פעילות הרשת בתרבויות glutamatergic. איור 1: טיהור הglutamatergic והנוירונים הגאייגיים. (א) תמונות המציגות אות פלורסנט מהביטוי הטרנזגנטי של TdTomato בנקמין; Ai9 עכברים (למעלה) ונוס בעכברים VGAT ונוס (למטה). קנה מידה ברים = 5 מ”מ. (ב) עוצמה פיזור מגרשים של TdTomato ו ונוס הזריחה של היפוטיקו-ההיפוקמאל תאים הנתק מתוך nexcre; Ai9 עכברים (למעלה) ועכברים VGAT ונוס (למטה). מאוד פלורסנט TdTomato או ונוס נוירונים נבחרו עבור מיון (המצוין על ידי תיבות ה, לעבור). (ג, שמאל) תמונות confocal וקד של TdTomato ממוין (למעלה) ו ונוס (למטה) נוירונים חיוביים. (ג, ימין) תמונה ממוזגת המציגה תאים מוכתמים באמצעות DAPI (בצבע כחול-מדומה). זריחה TdTomato הוא אנדוסוגני והוא נשאר חזק למרות הקיבעון (בצבע פסאודו מגנטה). ביטוי ונוס משופר באמצעות שילוב של נוגדן העיקרי בבימויו של GFP ו אלקסה Fluor-488-מצומת נוגדן משני (בצבע מדומה ירוק). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 2: תרבות התא של glutamatergic מטוהרים או הנוירונים. (A) תמונות אינפרא-אדום (שדה בהיר) משולב עם אות פלורסנט מתוך TdTomato (משמאל) ו-ונוס (מימין) נוירונים בצורה חיובית תרבותית עבור 1 h ב מבחנה. חיצים לבנים מציינים את המיקום של neurites גדל. (ב) מיקוד תמונות של TdTomato (משמאל) ו ונוס (מימין) נוירונים בצורה חיובית תרבותית עבור 1 h ב מבחנה. (ג, ד) שדה בהיר (למעלה) ומשולבים בתמונות פלורסנט (למטה) של TdTomato (C) ו-ונוס נוירונים (D) תרבותי במשך 7 ימים בתחום החוץ (DIV). חיצים לבנים מראים את המיקום. של גרעין מרוכז מתאים מתים חיצים צבעוניים לזהות הנוירונים בעלי תווית בעקשנות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 3: תכונות מורפולוגיות, אלקטרופיזיולוגיות וסינפטית של נוירונים מטוהרים. (א, ב) תמונות confocal וקד של TdTomato (A) ו ונוס חיובי נוירונים (ב) ב DIV 13 ו-DIV 14, בהתאמה. תאים מוצגים בשחור באמצעות שולחן המראה הפוכה כדי לסייע neurite הדמיה. מערכות insets מציגות את אות הפלורסנט המבוטאת על ידי הנוירונים שזוהו. (ג, ד) תגובת מתח של TdTomato (ג) ו-ונוס תא העצב (D) כדי להיפרפולזציה (200 to-20 הרשות הפלסטינית, ב 20 הצעדים הפלסטינית) ו לבצע הקיטוב (200 pA) הזרמים הנוכחיים, המתקבלים על ידי הקלטה שלמה של התיקון-מלחציים. Insets להציג את הנוירונים המוקלט המתאימים. פוטנציאל הממברנה המנוחה של כל תא מסומן משמאל למעקב אחר ההקלטה. (E, F) הקלטות מהדק מתח הנציג (10 s) המתקבלים TdTomato (E) ו-ונוס הנוירונים חיוביים (F). האירועים הEPSCs מרגש ספונטנית (הקלטה) הוקלטו מתוך נוירונים חיוביים TdTomato, מתוחזק בפוטנציאל מחזיק של 50 mV. באופן ספונטני אירועים פוסט סינפטית מעכבות (IPSCs) נרשמו מתוך ונוס הנוירונים חיוביים המתוחזקות בפוטנציאל מחזיק 0 mV. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 4: תמיכה בפיתוח תא העצב עם שיתוף התרבות גליה. (א) מיקוד תמונות של תרבויות גליה החיסונית עבור גליה fibrillary חלבון חומצי (gfap, שמאל), אשכול של מולקולה בידול (CD11b, באמצע) וחלבון בסיסי המיאלין (mbp, ימין). תאים גליאל היו מתורבתים עבור DIV 7. (ב) תמונות של תרבות התא מוסיפה לשימוש בתאי גליה משותפים עם נוירונים מטוהרים בסידור שאינו קשור למגע. (ג) סכמטי של ההסדר המרחבי המשמש לשיתוף הנוירונים והתרבות של גליה. (ד, ה) תמונות confocal וקד של tdtomato (D) ו-ונוס הנוירונים חיוביים (E), גדל עבור 14 ימים, בהעדר (שמאל) או נוכחות (מימין) של תמיכה גליה. (F, G) הקלטות נוכחיות-קלאמפ (60 s) מ-tdtomato (F) ו-ונוס נוירונים (G) תרבותית עבור 14 ימים בהעדר (למעלה) או נוכחות (למטה) של תמיכה גליה. נוירונים הוקלטו הפוטנציאל שלהם הממברנה מנוחה (מוצג משמאל של כל מעקב הקלטה). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

אנו מתארים כאן שיטה המשלבת את המיון והculturing של נוירונים ראשוניים כדי ליצור תרביות תאים עצביים מטוהרים. שיטה זו לוקח בערך 1 h יותר מאשר פרוטוקול אופייני העיקרי התרבות העצבית הבסיסית עדיין מאפשר את הדור של מאות תרבויות שכפול המכיל סוגים עצביים ספציפיים. הנוירונים מטוהרים, אשר ניתן לגדל בבידוד לפחות 16 ימים, להאריך אקסונים ודנדריטים והוא יכול לפטר רכבות חוזרות של פוטנציאל פעולה (איור 2 ואיור 3). וחשוב מכך, תאים אלה הם מקבילות לאותם מנתח ניסיוני כמו תרבויות נוירואליות העיקרי הנתק הראשוני, כולל אלקטרופיזיולוגיה, ניתוח מורפולוגיים והישרדות. היתרון העיקרי של עבודה עם תרבויות אלה מטוהרים הוא כי התפתחות של סוגי תאים ספציפיים ניתן ללמוד בבידוד. כדי לתמוך בפיתוח של תרבויות מטוהרים, אנו גם מציגים פרוטוקול עבור שיתוף culturing נוירונים מטוהרים עם תאי גליה. כפי שמוצג קודם לכן, co-culturing מטוהרים נוירונים עם תאים גליה משפר את ההישרדות שלהם, צמיחה והוא יכול לקדם את היווצרות הרשת⁷ (איור 4). כך, אנו מציגים כאן שילוב של שיטות שאמורות לקדם את המחקר של האינטראקציות גליה-נוירונים והוא עשוי להיות שימושי לחקר הפיתוח והאינטראקציה בין סוגי תאים אחרים של העניין.

מחקרים על תרבויות של מטוהרים glutamatergic נוירונים חשפו תובנות בסיסיות לדרך תאים גליה להפריש גורמים המקדמים את הפיתוח של רשתות נוירוונאליות והיווצרות סינפסה¹⁶^,¹⁷^,¹⁸. באופן כללי, שיטות לטיהור סוגים ספציפיים של תא העצב הוחלו בהצלחה רבה יותר כדי ללמוד את התפתחותם של הנוירונים הglutamatergic במקום נוירונים GABAergic. זה הוביל לפער בהבנת האופן שבו שני סוגי תאים אלה מתפתחים. בהינתן כי GABAergic ו glutamatergic הנוירונים שונים באופן משמעותי במונחים של האנטומיה שלהם, פיזיולוגיה ומקורות התפתחותיות, זה חיוני כי אנו לומדים הנוירונים GABAergic בזכות שלהם, כדי להבין טוב יותר את תפקידם ואת הפיזיולוגיה. באמצעות הפרוטוקול המוצג כאן, זיהינו בעבר הבדלים חשובים בדרך GABAergic ו glutamatergic נוירונים תלוי בגורמים גליה-מופרש להקמת שידור סינפטית⁷. על ידי פרסום פרוטוקול זה אנו מקווים כי אחרים יכולים לעשות תובנות נוספות לתוך האינטראקציות החשובות בין נוירונים ותאי גליה.

בפרוטוקול זה, אנו מתארים את הזרימה cy, לנסות שיטת מיון התא, אשר השתמשנו כדי לטהר GABAergic או glutamatergic נוירונים מתוך קווי מכרסמים שונים הטרנסגניים. ונוס הנוירונים בצורה חיובית GABAergic ממוינים VGAT ונוס עכברים¹³ או חולדות⁸ ו-tdtomato חיובי glutamatergic הנוירונים היו ממוינים מתוך nexcre Ai9 עכברים (שנולדו במקור מ NexCre⁹ ו Ai9 שורות הכתב⁶, ראה turko et al., 2018⁷). בשנים האחרונות, בגלל הפיתוחים הטכנולוגיים, הפכו הדור של חיות הטרנסגניים לקלים יותר באופן משמעותי. ככזה, הזמינות של בעלי חיים המבטא מולקולות פלורסנט, בסוגים רבים של תאים שונים, גדל במהירות. זה, בתורו, הגביר את השימוש והישימות של מיון התא המופעל פלורסנט. בעוד ששיטות חלופיות לבידוד תאי עניין הקיימות כיום¹⁶^,¹⁹^,²⁰, הן מודרכים במידה מסוימת על ידי התלות שלהם על הזמינות של נוגדנים מתאימים למשטח טבעי אנטיגנים. זה מגביל את צדדיות שלהם בהשוואה עם שיטות מיון מבוסס-פלואורסצנטית תא, אשר ניתן כבר להשתמש כדי למיין תאים מתוך הרבים תאים מסוימים העיתונאי הטרנסגניים שכבר זמינים. עם זאת, כאשר ממוטבת, מבוססי נוגדן שיטות מיון יכול להיות מהיר ומניב גבוה, ואולי אפילו טוב יותר לשמר את אנטומיה התא, על ידי התרת טיהור של תאים עם אקסונים שלהם ו דנדטים²¹שלמים. לפיכך, שיטות מיון נוגדנים צריכות להיחשב עדיין כאשר מחליטים על אסטרטגיית מיון. בסופו של דבר, סוג התא של עניין, את הגיל שבו תאים ממוינים, הזמינות של בעלי חיים טרנסגניים או אנטיגנים פני השטח ואת מספר התאים הדרושים יהיו הגורמים המכריע בעת בחירת אסטרטגיית המיון המתאימה ביותר.

למרות מיון התא המבוסס על קרינה פלואורסצנטית הוא שיטה פשוטה ומיועלת לטיהור תאים, יש לנקוט טיפול בשלבים מסוימים של הפרוטוקול כדי לשמר את איכות התאים. למשל, לאחר כל צעד צנטריפוגה, חשוב לוודא כי הגלולה התא מושעה מחדש מהר ככל האפשר, תאים ששוחזרו בהצלחה. לעיתים, ניתן להפריע לגלולה הסלולרית בעת הסרת הסופרנטאנט. לכן מומלץ, בין צנטריפוגה צעדים, כדי לבדוק את נוכחות של תאים תחת המיקרוסקופ כדי לשלול כל אובדן התאים הנרחב. לאחר ציפוי התא, יש לאפשר לתאים לדבוק לפחות 1 h לפני האכלה. אם התאים מוזנים מוקדם מדי, תאים מסוימים עלולים להיות מחליקים מתוך הכיסויים, ובכך להקטין את צפיפות התרבות. לאחר 1 h בתרבות, זה נבון להעריך את בריאות התא. אם תאים אינם מופיעים בריאים (דוגמה לתאים בריאים מוצג באיור 2A), או שיש מוות משמעותי בתאים, הדבר עשוי להוות אינדיקציה לבעיה במהלך הליך הדיסוציאציה או המיון. שיקול חשוב נוסף, כאשר culturing כל סוג תא, היא לדאוג בעת ניהול מדיה תרבות התא. מדיית ה-NBA מכילה אדום פנול, המשמש כמחוון pH²². אם המדיה הופכת צהובה מדי בצבע, אז זה מצביע על כך pH הוא חומצי מדי; אם המדיה נעשית ורודה מדי, הדבר מצביע על כך שהפתרון הוא בסיסי מדי. פתרונות מניות פתוחים לפרקי זמן ארוכים, בעיקר אמצעי תקשורת המצוטטים בצינורות חרוטיים, נוטים להפוך ליותר אלקליין לאורך זמן. לכן מומלץ ליצור מדיה חדשה מלאה ב-NBA בכל שבוע ומדיה להשלים כל שבועיים (מאגרי בינוני תחת תנאים אטמוספריים ולכן צריך להיות יציב יותר). לקיחת נקודות אלה בחשבון זה צריך להיות אפשרי כדי ליצור תרביות תאים מטוהרים בכל מעבדה עם גישה מיון התא וציוד תרבות התא.

ברוב הניסויים שלנו הצלחנו לייצר תרבויות מטוהרים מחיה אחת. עם זאת, בעת טיהור תאים עבור ניתוחים ביוכימיים, ייתכן שיהיה צורך לבריכה יחד בעלי חיים מרובים למיון. בהצלחה מוינו עד 8 עכברים עובריים (יום מעובריים 13 בעלי חיים) באמצעות פרוטוקול הנ ל (נתונים לא מוצגים). עם זאת, אם יש יותר בעלי חיים להיות ממוינים, ייתכן שיהיה צורך להגדיל את הנפח של שניהם פפאין ו-bsa פתרונות (מתוארים בשלבים 2.1.1 – 2.1.4) כדי להתאים את הגידול בכמות הרקמה. בנוסף, אם יותר תאים מצופים בתרבות, ייתכן שיידרש לוח זמנים תכוף יותר להזנה. כנקודת התחלה, תאים יכולים להיות מוזנים כל 7 ימים על ידי הסרת 100 μL של מדיה ממוזג והוספת 200 μL של מדיה חדשה להשלים ה-NBA. למען יכולת הקיום של הנוירונים, אם למיין יותר בעלי חיים, המחשבה צריכה להיות ניתנת כדי למזער את זמן המיון ככל האפשר. זה דורש לעתים קרובות אופטימיזציה קפדנית של ניתוחי במורד הזרם לשימוש יעיל של תאים מטוהרים. יש לנו מיון שגרתי הנוירונים בעכבר בשיעור של 600 אירועים/s, עד 500000 – 800000 תאים לכל בעל חיים (לאחר לידה 0 – 2). עם זאת, זה היה ללא אופטימיזציה ממצה של מהירויות מיון ותנאים. לכן, שיפורים נוספים במהירות המיון ובתשואה צריכים להיות אפשריים.

הנוירונים מטוהרים דורשים מדיה ממוזג להישרדותה. זה כבר הוכח בעבר על ידי הנוירונים culturing ותאי גליה בנפרד, לפני טיפול בנוירונים עם מזגן גליה מדיה¹⁰. בניסויים שלנו, בחרנו לתמוך בנוירונים מטוהרים על ידי תאים גליה culturing על למחצה חדיר תרבות התא מוסיף, אשר ממוקמים בתוך לוחית התרבות התא. שיטה זו חלה בהצלחה ללמוד מטריקס הנגזרים מטריצות חלבונים האינטראקציה שלהם עם נוירונים¹². התמיכה הרציפה המסופקת באמצעות שיטה זו כוללת מספר יתרונות בהשוואה לתרבות התאים הנפרדת. בעיקר, שיתוף התרבות של תאים גליה עם נוירונים מאפשר רגולציה רציפה ומיזוג של התקשורת תרבות התא, אשר דומה יותר במצב vivo. בנוסף, שיתוף התרבות הרציפה של תאים מאפשר איתות משוב פוטנציאלי בין נוירונים ו גליה, אשר אינו אפשרי בתרבויות מופרדות. בפרוטוקול שלנו, אם נדרש, שיטת שיתוף התרבות הרציפה ניתן להשמיט בקלות וטיפול קלאסי של נוירונים עם מדיה ממוזג-glia ניתן לבצע.

לסיכום, הפרוטוקול המוצג כאן שואפת לספק לקורא בסיס מוצק שממנו הם יכולים לבסס את הניסויים שלהם בתרבות התא הטהור. אנו מנבאות כי הזמינות של בעלי חיים טרנסגניים ומבנים ויראליות תמשיך להגדיל לעתיד הקרוב. לכן, טכניקות מיון התא מבוסס על הזריחה צפויים להיות אפילו יותר נפוץ ויקר.

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים רוצים להודות לתמיכה טכנית מעולה שסופקו על ידי ג’ני קירש ואנה טאיצ’יולר בזרם CyDeutsches Try ליבה מתקן, Rheuma-Forschtok, ברלין. אנחנו רוצים להודות לג’אי סונג. על עזרתו בניתוח הישרדות כמו כן, אנו רוצים להודות לריטה לוברו על עזרתה בלכידת התמונות של עכברי פלורסנט וכריסטיאן אבנר לקריאה קריטית של הפרוטוקול. החולדות הטרנסגניות של VGAT-ונוס הופקו על ידי ד”ר י. יאנגאווה, מ. היגיאייאשי וכואגוצ’י במכון הלאומי למדעי הפיזיולוגיה, וקאזאקי, יפן, באמצעות pCS2-ונוס שסיפק ד ר א. מיאקי. עבודה זו נתמכת על ידי מועצת המחקר הגרמנית (דויטשה פורשונגססמייםהגבורהאחייסהאחג, DFG EXC 257 עד IV).

Materials

Neural Basal A media (NBA)	ThermoFisher Scientific	10888022	Cell Culture Buffer
B27	ThermoFisher Scientific	17504001	Culture supplement
Glutamax	ThermoFisher Scientific	35050-038	Culture supplement
Penicillin Streptomycin (10,000 U/mL)	ThermoFisher Scientific	15140-122	Antibiotic
Poly-L-Lysine	SIGMA	P1399	Coverslip coating
Papain	SIGMA	P4762-1G	Enzyme
Bovine Serum Albumin	SIGMA	A3294-100G	Serum
Hibernate A low fluorescence media	Brain Bits Ltd	HALF	Cell Transport media
Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM)	Biochrom	F0435	Glial Culture Buffer
Fetal Calf Serum (FCS)	Biochrom	S0115	Serum
Trypsin / EDTA	Biochrom	L2163	Enzyme
Fine Tip Pasteur Pipette	Neo Labs	–	Used for trituration of cells
24-well plates	BD	353047	Culture plate
50 mL Falcon tubes	BD	352070	–
15 mL Falcon tubes	BD	352096	–
Glass coverslips: 12 mm round	Roth	P231.1	–
35 mm Petri dish	Corning	353001	–
100 mm Petri dish	Corning	353003	–
30 µm CellTrics Cell Sieve	sysmex	04-004-2326	To remove cell clumps before cell sorting
Round bottom polystyrene tubes	BD	352054	Transport tube for sorted cells
Round bottom polypropylyne tubes	BD	352063	Collection tube for sorted cells
Cell culture inserts – 0.4 µm transparent PET	Falcon	353 095	For the co-culture of neurons and glia
Extra fine Bonn Scissors	Fine Scientific Tools	14084-08	To remove overlying skin and bone of mice
Extra narrow Scissors	Fine Scientific Tools	14088-10	To remove overlying skin and bone of rats
Forceps	Fine Scientific Tools	11242-40	To hold the head in place
Spatula (130 mm long / 5 mm tip width)	Fine Scientific Tools	3006.1	To remove the brain to filter paper
Scalpel Blades	Swan-Morton	#0308	To mechanically dissociate neural tissue
Haemocytometer (Neubauer Imroved)	Optik Labor	–	To cell count dissociated cells
Fluorescent Miners Goggles (excitation light)	Biological Laboratory Equipment Maintenance and Servce Ltd (BLS)	FHS/LS-1G	To excite TdTomato
Fluorescent Miners Goggles (emission filter)	Biological Laboratory Equipment Maintenance and Servce Ltd (BLS)	FHS/EF-4R2	Td Tomato compatible emission filter
Fluorescent Miners Goggles (excitation light)	Biological Laboratory Equipment Maintenance and Servce Ltd (BLS)	FS/ULS-02B2	To excite Venus
Fluorescent Miners Goggles (emission filter)	Biological Laboratory Equipment Maintenance and Servce Ltd (BLS)	FS/TEF-3GY1	Venus compatible emission filter
Mouse-Anti-GFP primary antibodies	UC Davis	75-132	To enhance Venus signal following fixation
Mouse-Anti-GFAP primary antibodies	SIGMA	G-3893	The identification of reactive astrocytes
Rabbit-Anti-CD11b primary antibodies	Southern Biotech	1561-15	The identification of microglial cells
Rabbit-Anti-MBP primary antibodies	Millipore	AB980	The identification of oligodendrocyes

Referanslar

Radcliff, G., Jaroszeski, M. J. Basics of flow cytometry. Methods in Molecular Biology. 91, 1-24 (1998).
Feher, K., Kirsch, J., Radbruch, A., Chang, H. D., Kaiser, T. Cell population identification using fluorescence-minus-one controls with a one-class classifying algorithm. Biyoinformatik. 30 (23), 3372-3378 (2014).
Sergent-Tanguy, S., Chagneau, C., Neveu, I., Naveilhan, P. Fluorescent activated cell sorting (FACS): a rapid and reliable method to estimate the number of neurons in a mixed population. Journal of Neuroscience Methods. 129 (1), 73-79 (2003).
Adan, A., Alizada, G., Kiraz, Y., Baran, Y., Nalbant, A. Flow cytometry: basic principles and applications. Critical Reviews in Biotechnology. 37 (2), 163-176 (2017).
Guez-Barber, D., et al. FACS purification of immunolabeled cell types from adult rat brain. Journal of Neuroscience Methods. 203 (1), 10-18 (2012).
Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
Turko, P., Groberman, K., Browa, F., Cobb, S., Vida, I. Differential Dependence of GABAergic and Glutamatergic Neurons on Glia for the Establishment of Synaptic Transmission. Cerebral Cortex. , (2018).
Uematsu, M., et al. Quantitative chemical composition of cortical gabaergic neurons revealed in transgenic venus-expressing rats. Cerebral Cortex. 18, 315-330 (2008).
Goebbels, S., Bormuth, I., Bode, U., Hermanson, O., Schwab, M. H., Nave, K. -. A. Genetic targeting of principal neurons in neocortex and hippocampus of NEX-Cre mice. Genesis. 44, 611-621 (2006).
Banker, G. A. Trophic interactions between astroglial cells and hippocampal neurons in culture. Science. 209, 809-810 (1980).
Lindsay, R. M. Adult rat brain astrocytes support survival of both NGF-dependent and NGF-insensitive neurones. Nature. 282 (5734), 80-82 (1979).
Geissler, M., et al. Primary hippocampal neurons, which lack four crucial extracellular matrix molecules, display abnormalities of synaptic structure and function and severe deficits in perineuronal net formation. Journal of Neuroscience. 33 (18), 7742-7755 (2013).
Wang, Y., et al. Fluorescent labeling of both gabaergicand glycinergic neurons in vesicular GABA transporter (VGAT)-venus transgenic mouse. Nörobilim. 164 (3), 1031-1043 (2009).
Höltje, M., et al. Role of Rho gtpasein astrocyte morphology and migratory response during in vitro wound healing. Journal of Neurochemistry. 95 (5), 1237-1248 (2005).
Booker, S. A., Song, J., Vida, I. Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons. Journal of Visualized Experiments. , e51706 (2014).
Pfrieger, F. W., Barres, B. A. Synaptic efficacy enhanced by glial cells in vitro. Science. 277 (5332), 1684-1687 (1997).
Ullian, E. M., Sapperstein, S. K., Christopherson, K. S., Barres, B. A. Control of synapse number by glia. Science. 291, 657-661 (2001).
Christopherson, K. S., et al. Thrombospondins are astrocyte-secreted proteins that promote CNS synaptogenesis. Cell. 120, 421-433 (2005).
Berghuis, P., et al. Brain-derived neurotrophic factor controls functional differentiation and microcircuit formation of selectively isolated fast-spiking gabaergic interneurons. European Journal of Neuroscience. 20 (5), 1290-1306 (2004).
Liddelow, S. A., et al. Activated microglia induce neurotoxic reactive astrocytes via Il-1α, tnfα, and c1q. Nature. 541, 481-487 (2017).
Tomlinson, M. J., Tomlinson, S., Yang, X. B., Kirkham, J. Cell separation: Terminology and practical considerations. Journal of Tissue Engineering. 4, (2013).
Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. Journal of Neuroscience Research. 35 (5), 567-576 (1993).

Etiketler

Primary Cell Culture GABAergic Neurons Glutamatergic Neurons Fluorescence-activated Cell Sorting Neuronal Physiology Synapses Neuronal Networks PLL Coating Cell Culture Buffer BSA Papain Filter Sterilization

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Bu Makaleden Alıntı Yapın

Turko, P., Groberman, K., Kaiser, T., Yanagawa, Y., Vida, I. Primary Cell Culture of Purified GABAergic or Glutamatergic Neurons Established through Fluorescence-activated Cell Sorting. J. Vis. Exp. (148), e58974, doi:10.3791/58974 (2019).