全 Genomic DNA 分析のための超長いリード シーケンス

注: NLR seq プロトコル 3 連続ステップで構成されています: 1) 高分子の抽出重量分画法ゲノム DNA;任意の大きさに見られる DNA の断片化と dna シーケンス アダプターの ligation が含まれています 2) 超長い DNA ライブラリ構築終了します。・ 3) アダプター結紮 DNA ナノ細孔 (図 1) のアレイへの読み込み。 1. 高分子 DNA の抽出 試薬のセットアップ。100 mL の PBS を追加することによってリン酸バッファー生理食塩水 (PBS) バッファー (1,000 mL) × 1 を作る (10 倍) を 900 mL の水とよく混ぜる。換散バッファー (50 mL) を 50 mL チューブに 43.5 mL の水を追加してください。エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) (0.5 M、pH 8.0) の 2.5 mL トリス (1 M, pH 8.0)、塩化ナトリウム (NaCl) (5 M) の 1 つの mL の 500 μ L を追加し、ナトリウム ドデシル 2.5 mL チューブ (SDS) (10%、wt/巻) の硫酸塩しよく混ぜます。注: この PBS バッファーは 4 ° C で最大 6 ヶ月間保存できます。既成の換散バッファーは、最大 2 ヶ月間常温保存できます。 セル死亡を確認し、セルをカウントします。ライブは、> 85%、総細胞数は 30 × 106を確認します。注: このプロトコルで使用される細胞は、1000 ゲノム コンソーシアム構造変化分析のため広くプエルトリコ出身のヒトリンパ芽球細胞株 HG00733 細胞株 (注文情報用材料の表を参照)、所属国際ゲノム サンプル リソース。 RT。 破棄中で 5 分間 200 × gで遠心分離によって細胞を収集し、1 x PBS バッファーの 5 ml (30 x 106細胞) 細胞ペレットを再懸濁します。再び常温 5 分 200 x gで遠心し、上澄みを廃棄します。注: 25-35 10 x6セルはこのアプローチのため。さらにさまざまな量の使用されているセルは、最適化に必要。細胞ペレットは、−80 ° C で 6 ヶ月保存できます。 1 x PBS バッファーの 200 μ l 細胞ペレットを再懸濁します。凍結細胞ペレットを使用している場合は、5 mL の 1x PBS バッファーで洗浄します。遠心分離機の RT で 5 分間 200 x gでソリューション、上澄みを廃棄し、PBS バッファー x 1 の 200 μ L で細胞を再懸濁します。 10 mL を 50 mL のチューブでの換散バッファーを準備します。3 s. 加温 1 h 37 ° C でソリューションの換散バッファーと最高速度で渦に 200 μ L 細胞懸濁液を追加します。 ライセートに rnase A 2 μ L (100 mg/mL) を追加します。サンプルをミックスに 50 mL のチューブを慎重に下ろします。1 h の 37 ° C でソリューションを孵化させなさい。 ライセートに 50 μ L プロティナーゼ K (20 mg/mL) を追加します。サンプルをミックスに 50 mL のチューブを慎重に下ろします。2 h 50 ° C でソリューションを孵化させなさい。、インキュベーション中に、30 分毎にサンプルをミックス優しく。 50 ° C から 50 mL のチューブを外し、5 分間室温で放置します。 ライセートにフェノール: クロロホルム: イソアミル アルコール (25:24:1、巻/巻/巻) のフェノール層の 10 mL を追加し、回転ミキサーでチューブを回転させて (材料表参照) 常温で 10 分間 20 rpm で発煙のフード ラップ漏れを防ぐためにパラフィルムでチューブ キャップ回転中に 右で 2 分間 1,500 × gで遠心分離 (材料の表を参照してください)、2 つの 50 mL ゲル管を準備します。注: ゲルは、核酸を含む水相と有機溶剤の安定したバリアを形成します。 ステップは 1.10 からゲル チューブ、50 mL の準備の一つにサンプル/フェノール溶液を注ぐ。3,000 × g 10 分間室温で溶液を遠心分離します。 新しい 50 mL のチューブに上清を注ぐ。フェノール: クロロホルム: イソアミル アルコール (25:24:1、巻/巻/巻) のフェノール層の 10 mL を追加し、10 分の 20 の rpm で発煙のフード RT で回転子のミキサーのチューブを回転させます。 2 番目に一度準備ステップ 1.11 ゲル管を繰り返します。 新しい 50 mL のチューブに上清を注ぐ。冷えた 100% エタノール 25 mL を追加し、DNA を沈殿させる (図 2) まで、チューブを手で優しく回転します。注: 降水量アプローチは、高分子 DNA を安定させるために役立ちます。 フックに 20 μ L の先端を曲げます。慎重にフックを用いて DNA を取り出し、液体のドロップはオフしましょう。 70% のエタノールの 40 mL を含む 50 mL のチューブに高分子 DNA を配置します。3 回チューブを軽く反転による DNA を洗浄します。 1.15 一度 70% エタノール チューブから DNA を収集する手順を繰り返します。 70% のエタノールの 1.8 mL を含む 2 mL チューブに高分子 DNA を配置します。 3 10,000 x gで洗った HMW DNA を遠心分離機ピペッティングにより可能な限り残留エタノールのルート削除で s。注: 残留エタノールをピペッティング時に、DNA の餌に不可します。 蓋が開いた試料を乾燥させると 10 分のための 37 ° C で 2 mL チューブを孵化させなさい。 2.1 機械的剪断と 1 D 結紮シーケンス キット) のステップを続行、2 mL チューブに TE (10 mM トリスと 1 ミリメートルの EDTA、pH 8.0) の 1 つの mL を追加します。 0.02% と 10 ミリメートル トリス (pH 8.0) の 200 μ L を追加 (トランスポザーゼ ベースの断片化、急速なシーケンス キットと)、手順 2.2 を続ける場合トリトン X-100。注:、DNA の餌が不可します。48 h のため暗闇の中で 4 ° C に立つチューブをさせる完全に再懸濁しますサンプルに役立ちます。HMW DNA は、最大 2 週間までの 4 ° C で保存できます。ストレージ時間やその他のストレージの条件より短い断片を導入可能性があります。 2. 超長い DNA ライブラリ構築 注意: ナノポア シーケンス キットと相まって 2 つ異なるせん断方法に基づいて超長い DNA ライブラリを構築する 2 つの方法があります。機械的せん断ベースのライブラリは、ライブラリ構築の約 8 時間を取る 50-70 kb の N50 を使用してデータを生成します。トランスポザーゼ断片化ベースのライブラリは、ライブラリ構築にわずか 90 分を取って 90 100 kb のデータの N50 を生成します。機械的せん断プロトコルは、入力シーケンス アダプターとナノポア フローセルの品質の同一バージョンを使用して同じ DNA からより高い利回りを与えます。 機械的剪断に基づく図書館の建設 雪解けとミックス結紮から試薬キット (材料の表を参照してください)。雪解け FFPE DNA はバッファーと氷、渦の上終わり修理/ダ-テーリング バッファーを修復し、ミックス ダウンしてスピンします。ミックス ダウン アダプター ミックス (AMX) とアダプター ビーズ結合バッファー (ABB) 氷し、ピペットとスピンを解凍します。ダウン ミックスに燃料ミックス (RBF) と連続したバッファーとスピンし渦 RT で溶出バッファー (エルプ) を解凍します。RT とピペットの使用の前に混合するライブラリのロードのビーズ (LLB) を解凍します。 解凍後、氷の上のすべてのキット部品を保ちます。必要なときだけ酵素を取り出してください。Rt 用磁気ビーズをもたらします。注: 使用する磁気ビーズに関する推奨事項は、材料の表を参照してください。 1.21.1 のステップから見られる DNA の量と質を確認してください。P200 ワイドを使用して見られる DNA チューブの 3 つの異なる場所から新しい 1.5 mL チューブに DNA の 20 μ L をピペットは、ヒントを退屈させます。蛍光光度計と読んで UV を使用して品質を使用して濃度を検出する 3 つの因数から 1 μ L を取る。複数回、結果を確認するを確認します。注:図 3 aで期待どおりの結果が表示されます。OD260/280値は約 1.9 と OD260/230値は約 2.3。 転送広い P1000 を 50 mL チューブ キャップに見られる DNA の残りの 940 μ L チップを産んだ。 1 mL 注射器針なしにすべての DNA を吸い出しなさい。 27 G 針を注射器に入れ、静かにゆっくりと、キャップにすべての DNA を取り出す (~ 10 秒)。注射器から 27 G 針を外してください。 30 パスの合計 29 回の針を介して手順 2.1.4 と 2.1.5 を繰り返します。注: せん断破壊 DNA は 24 h. 品質管理 (QC) までは脈打フィールドゲルの電気泳動によって強くお勧めしますが、それは高価、時間のかかる、暗闇の中で 4 ° C で保存できます。自動パルス フィールド ゲル電気泳動機械の品質管理を実行している場合は、実行 20 h 5 150 kb プロトコルを使用します。期待される結果は、図 4のとおりです。 せん断破壊 DNA の 100 μ L の追加によって 0.2 mL チューブで DNA 修復反応を準備 (20 μ g) FFPE DNA 修復バッファーの 15 μ L、FFPE DNA 修復ミックスの 12 μ L、ヌクレアーゼ フリー水の 16 μ L。6 回軽くフリックすることで反応をミックスし、削除泡までスピンします。 60 分転送のための 20 の ° C で反応、p200 でも大口径ヒントを新しい 1.5 mL チューブにサンプルをインキュベートします。 ピペッティングまたはボルテックスによって磁気ビーズを再懸濁します。6 回チューブをフリックで優しく DNA 修復反応とミックスに 143 μ L ビーズ (1 x) を追加します。30 分の 20 の rpm で RT で回転子のミキサーのチューブを回転させます。 2 1,000 x gでサンプル スピンダウンした場所で 10 分間磁気ラックにチューブで s 磁気ラックにチューブを維持し、上澄みを廃棄します。 磁気ラックにチューブを維持、ペレットを乱すことがなく作りたての 70% のエタノールの 400 μ L を追加します。30 後 70% エタノールを削除 s。 2.1.11 の手順をもう一度繰り返します。 2 1,000 x gでサンプルをスピン磁気ラック背面チューブした場所で s。任意の残留エタノールを外し、空気乾燥 30 s。以上、ペレットを乾燥しないでください。 磁気ラックからチューブを外し、TE (10 mM トリスと 1 ミリメートルの EDTA、pH 8.0) の 103 μ L を追加します。軽くフリック ビーズ バッファーで覆われているし、軽く 30 分常温回転ミキサーで孵化させなさいようにチューブはペレットの再懸濁のためチューブ 5 分ごとをフリックします。 P200 でも広いと溶出液の少なくとも 10 分転送 100 μ L 穴 0.2 mL チューブ先端の磁気ラックのビーズをペレットします。 修理 HMW DNA の 100 μ L、14 μ L エンド修理/ダ-テーリング バッファーの終わり修理/ダ-テーリング ミックスの 7 μ L を追加して終わり修理および 0.2 mL チューブで dA テーリング反応を準備します。6 回、軽くフリックすることで反応をミックスし、削除泡までスピンします。 60 分の 65 ° C 20 分続いて 20 ° C で反応をインキュベートし、22 ° C で押し転送 p200 でもワイドを使用して新しい 1.5 mL チューブにサンプルを退屈させるヒントします。 ピペッティングまたはボルテックスによって磁気ビーズを再懸濁します。ビーズの 48 μ L を追加 (0.4 倍) 終わり修理/ダ-テーリング反応と静か 6 回チューブをフリックでミックスします。30 分の 20 の rpm で RT で回転子のミキサーのチューブを回転させます。 2.1.10-2.1.13 の手順をもう一度繰り返します。 磁気ラックからチューブを外し、TE (10 mM トリスと 1 ミリメートルの EDTA、pH 8.0) の 33 μ L を追加します。軽くフリック ビーズ バッファーで覆われているし、軽く 30 分常温回転ミキサーで孵化させなさいようにチューブはペレットの再懸濁のためチューブ 5 分ごとをフリックします。 P200 でも広いと溶出液の少なくとも 10 分転送 30 μ L を新しい 1.5 mL チューブ先端の穴の磁気ラックのビーズをペレットします。蛍光光度計を用いた濃度を検出する余分 1-2 μ L を取る。注: この手順で 5-6 μ g の回復が期待されます。 最後修理 HMW DNA の追加 30 μ L で 1.5 mL のサンプル チューブの ligation の反作用、アダプター ミックス (1 D)、AMX の 20 μ L、鈍/TA 結紮マスター ミックスの 50 μ L を準備します。それぞれ順次追加と削除泡までスピン間 6 回軽くフリックすることで反応をミックスします。 60 分間室温で反応を孵化させなさい。 ピペッティングまたはボルテックスによって磁気ビーズを再懸濁します。40 μ L ビーズを追加 (0.4 倍) ligation の反作用と静か 6 回チューブをフリックでミックスします。30 分の 20 の rpm で RT で回転子のミキサーのチューブを回転させます。 2.1.10 の手順をもう一度繰り返します。 チューブにアダプター ビーズ結合 (ABB) バッファーの 400 μ L を追加します。軽く 6 倍のチューブをフリックすると、ビードを再停止しなさい。バッファーからビーズを分離し上澄みを廃棄磁気ラックにチューブを置きます。 2.1.26 の手順をもう一度繰り返します。 2 1,000 x gでサンプルをスピン磁気ラック背面チューブした場所で s。残留バッファーを削除し、空気乾燥 30 s。以上、ペレットを乾燥しないでください。 磁気ラックからチューブを外し、43 μ L の溶出バッファーでペレットを再懸濁します。軽くフリック ビーズ バッファーで覆われているし、軽く 30 分常温回転ミキサーで孵化させなさいようにチューブはペレットの再懸濁のためチューブ 5 分ごとをフリックします。 P200 でも広いと溶出液の少なくとも 10 分転送 40 μ L を新しい 1.5 mL チューブ先端の穴の磁気ラックのビーズをペレットします。蛍光光度計を用いた濃度を検出する余分 1-2 μ L を取る。注: この手順で 1-2 μ g の回復が期待されます。機械的せん断ベース ライブラリを読み込む準備が整います。ライブラリは、必要な場合に、シーケンスの読み込みまで 2 h までの氷の上格納できます。 トランスポザーゼ断片化ベース ライブラリの構築 雪解け、トランスポザーゼから試薬キット (材料の表を参照してください)。断片化ミックス (FRA) とミックスする氷とピペットの急速なアダプター (RAP) を解凍します。ビーズ (LB) を読み込み配列バッファー (SQB) を解凍、バッファー (FLB) フラッシュし RT でテザー (FLT) をフラッシュし、ミックスするピペットします。使用の前に混合する RT とピペットで読み込みビーズ (LB) を解凍します。解凍後、氷の上のすべてのキット部品を保ちます。必要なときだけ酵素を取り出してください。 1.21.2 のステップから見られる DNA の量と質を確認してください。P200 ワイドを使用して見られる DNA チューブの 3 つの異なる場所から新しい 1.5 mL チューブに DNA の 20 μ L をピペットは、ヒントを退屈させます。蛍光光度計と読んで UV を使用して品質を使用して濃度を検出する 3 つの因数から 1 μ L を取る。複数回、結果を確認するを確認します。注: 期待どおりの結果が図 3 bに表示されます。OD260/280値は約 1.9 と OD260/230値は約 2.3。 HMW DNA 断片化の 0.02% トリトン X-100 と 1 μ L とトリス (pH 8.0) ミックス (FRA) 10 mM の 1 μ L の 22 μ L の追加によって 0.2 mL チューブで DNA tagmentation 反応を準備します。P200 でもワイドでピペッティングによるミックスを結んだ先端に徐々 に可能な限り 6 回気泡を導入することの世話 1 分 1 分の 80 ° C に続いて 30 ° C で反応をインキュベートし、4 ° C で押し転送ミックス広い P200 を新しい 1.5 mL チューブに穴先端とすぐに次のステップに行く。 1.5 mL のサンプル チューブに 1 μ L の高速アダプター (RAP) を追加します。P200 でもワイドでピペッティングによるミックスを結んだ先端に徐々 に可能な限り 6 回気泡を導入することの世話 60 分間室温で反応を孵化させなさい。注: トランスポザーゼ断片化ベース ライブラリを読み込む準備が整います。ライブラリは、必要な場合に、シーケンスの読み込みまで 2 h までの氷の上格納できます。 3. ナノポア デバイスの配列 ナノ細孔シーケンシング デバイスを確認 (材料の表を参照してください)。ソフトウェアとハードウェアが動作と十分な空き容量があることを確認します。 フロー ・ セルを確認します。新しいフローセルを開き、ナノポア デバイスのフロー ・ セルに挿入します。(X1 X5) 挿入位置フロー ・ セルのボックスを確認します。正しいフロー セルの種類を選択します。流れ電池の確認ワークフローをクリックします。フローセル QC 分析を開始する [テストの開始] ボタンをクリックします。注: 報告された合計アクティブな孔数が 800 未満の場合は、配列の異なる新しいフローセルを使用します。 プライミング バッファーを準備します。機械的せん断ベースのライブラリでは、実行中の燃料ミックス (RBF) とバッファーと 624 576 μ L を追加 1.5 mL チューブにヌクレアーゼ フリー水の μ L。渦とミックス プライミング バッファーにスピン。トランスポザーゼ断片化ベースのライブラリでは、フラッシュ バッファー (FLB) のチューブにフラッシュ テザー (FLT) の 30 μ L を追加します。渦とミックス プライミング バッファーにスピン。 フロー ・ セルのプライミング ポートを公開する時計回りにプライミング ポートカバーを移動します。 P1000 ピペットを 100 μ L に設定し、先端をプライミング ポートに挿入します。少量のフロー ・ セルから任意の気泡を削除するバッファー (未満 30 μ L) を引きます。先端に入ると黄色い液の少量をピペッティングを停止します。 P1000 ピペットを使用して、プライミング ポート経由のフロー ・ セルにプライミング ミックスの 800 μ L を読み込みます。気泡を導入することを回避するには、最初、プライミング ポートの上部を覆う、プライミング ポートに先端を挿入し、ゆっくりとプライミング ミックスの残りの部分を追加するためにプライミング ミックスの 30 μ L を追加します。約 50 μ L 左がある場合は、先端を取り出してください。プライミング プライミング ポートの上にミックスの残りの部分を追加します。流体は、自分自身で内部を行くでしょう。 5 分間インキュベートするセットアップを残します。一方で、ライブラリを含む 1.5 mL チューブにライブラリ ミックスを準備します。注: 機械的せん断ベース ライブラリ DNA ライブラリの 40 μ L に燃料ミックス (RBF) と連続したバッファーの 35 μ L を追加します。トランスポザーゼ断片化ベース ライブラリの追加シーケンス バッファー (SQB) の 34 μ L と 16 μ L の DNA ライブラリを 25 μ l 添加するヌクレアーゼ フリー水。 サンプル ポートを公開する優しく流れ細胞サンプル ポート カバーを開きます。P1000 ピペットを使用して、3.5 の手順で説明したようのフロー ・ セルにプライミング ポートを介してプライミング ミックスの 200 μ L を追加します。サンプル ポートを介してフロー ・ セルにプライミング ミックスが読み込まれていないことを確認します。 P200 ピペットを 80 μ L に設定します。読み込み直前 6 回上下ピペッティングによる大口径先端穏やかライブラリを組合せ。 フロー ・ セルに、サンプル ポートを介して滴下ライブラリ ミックスをロードします。以前のドロップがポートに完全にロードされた後にのみ、それぞれのドロップを追加します。 サンプル ポート カバーをそっと戻さし、サンプル ポートは完全に覆われているかどうかを確認します。プライミング ポート カバーをプライミング ポートをカバーする反時計回りに移動します。デバイスを閉じた。 新しい実験ワークフローをクリックします。ライブラリの名前を入力、使用されるプロシージャに従って正しいキットを選択し、設定が正しい (48 h 実行、リアルタイム ベースの呼び出しに) であることを確認します。 実行を開始] をクリックします。10 分後、フロー セル ID 情報から実行アクティブ ナノポア数 (合計数と各 4 つのグループの番号) を記録します。 データ分析。いつでもシーケンス実行が完了すると、ローカル コンピューターまたはクラスターにデータをコピーします。Minimap216 (https://github.com/lh3/minimap2) を使用して、参照ゲノム シーケンス データを揃えます。NanoPlot17 (https://github.com/wdecoster/NanoPlot) によって塩基配列データ線形からシーケンスのパフォーマンスをまとめたものです。