用于全基因组 DNA 分析的超长读数测序

注: NLR-seq 协议由三个连续步骤组成: 1) 提取高分子量 (HMW) 基因组 DNA;2) 超长 DNA 文库构建, 包括将 HMW DNA 分解成所需的大小和将测序适配器连接到 DNA 端;3) 将自适应连接的 DNA 加载到纳米孔阵列上 (图 1)。 1. HMW DNA 提取 试剂设置。通过将100毫升的 PBS (10倍) 添加到900毫升的水和混合, 制成1x 磷酸盐缓冲液 (1, 000 毫升)。在50毫升管中加入 43.5 mL 的水, 制成裂解缓冲液 (50 毫升)。加入500μl 的 Tris (1 M, pH 8.0)、1毫升氯化钠 (氯化钠) (5m)、2.5 毫升乙二胺四乙酸 (EDTA) (0.5 M, pH 8.0) 和 2.5 mL 十二烷基硫酸钠 (SDS) (10%, wt/vol) 到管和混合良好。注: 此 PBS 缓冲器可在4°c 下存储长达6个月。预先制作的裂解缓冲液可在 RT 中存储长达2个月。 检查细胞死亡率并对细胞进行计数。确保活比 > 85%, 总电池数为 30 x 106.注: 本协议中使用的细胞来自 HG00733 细胞系, 这是一个人类的波多黎各裔淋巴细胞细胞系, 广泛用于1000个基因组联合会的结构变异分析 (见订购资料的材料表), 属于到国际基因组样本资源。 在 rt 处以 200 x g离心5分钟收集细胞, 丢弃培养基, 用 1X pbs 缓冲液的5毫升重新悬浮细胞颗粒 (30 x10 6细胞)。在 RT 以 200 x g的速度再次离心 5分钟, 并丢弃上清液。注: 这种方法可以接受 25-35 x10 6 的单元格。使用的细胞数量的进一步变化需要进一步优化。细胞颗粒可在-80°c 下储存长达6个月。 在 1x PBS 缓冲液的200Μl 中重新使用细胞颗粒。如果使用冷冻细胞颗粒, 用 1x PBS 缓冲液的5毫升清洗。在 RT 以 200 x g离心溶液 5分钟, 丢弃上清液, 并在1x-l 的 1X pbs 缓冲液中重新悬浮电池。 在50毫升管中制备10毫升的裂解缓冲液。将200Μl 细胞悬浮液加入裂解缓冲液中, 以最高速度旋转 3秒, 在37°c 下将溶液培养1小时。 在裂解液中加入2μl 的 RNase a (100 Mg/ml)。轻轻旋转50毫升管混合样品。在37°c 下将溶液生也就是1小时。 在裂解液中加入50μl 蛋白酶 K (20mg/ml)。轻轻旋转50毫升管混合样品。在50°c 下将溶液生也就是2小时。在孵育过程中, 每30分钟轻轻混合一次样品。 将50毫升管从50°c 中取出, 让支架在 RT 站5分钟。 加入10毫升的苯酚层: 氯仿: 异戊醇 (25:24/1, vol/vol2 vol) 到裂解液中, 并在 RPM 的旋转搅拌机上旋转管 (见材料表) 在转速 20 rpm 的烟罩中, 用副管包包 10分钟, 以防止泄漏在旋转过程中。 准备两个50毫升凝胶管 (见材料表), 在 1, 500 x 克离心2分钟。注: 凝胶在含核酸的水相和有机溶剂之间形成稳定的屏障。 将样品酚溶液倒进步骤1.10 中制备的50毫升凝胶管中的一个。在 RT 以 3, 000 x g的速度离心溶液10分钟。 将上清液倒进新的50毫升管中。加入10毫升的苯酚层: 氯仿: 异戊醇 (25:24:1, vol/vol/vol)), 并在 RPM 的旋转搅拌机上旋转管, 在转速 20 rpm 的通风柜10分钟。 用第二制备的凝胶管重复步骤1.11 一次。 将上清液倒进新的50毫升管中。加入25毫升的冰凉100% 乙醇, 用手轻轻旋转管, 直到 DNA 沉淀 (图 2)。注: 降水方法有助于稳定 HMW DNA。 弯曲20Μl 尖端, 制成钩子。小心地取出 HMW dna 与钩子, 让液体下降。 将 HMW DNA 放入含有40% 乙醇的50毫升管中。用轻轻倒置管3次来清洗 DNA。 重复步骤1.15 一次, 从70% 乙醇管中收集 DNA。 将 HMW DNA 放入含有 1.8 mL 乙醇的2毫升管中。 在 RT 以 10, 000 x克的速度离心清洗后的 HMW dna, 为 3秒. 通过移液中尽可能多地去除剩余乙醇。注: 在对残留乙醇进行移液处理时, 不要干扰 DNA 颗粒。 在37°c 下将2毫升管培养 10分钟, 盖子打开以干燥样品。 如果继续执行步骤 2.1 (机械剪切和1D 结扎测序套件), 在 2 mL 管中添加 1 mL 的 TE (10 mM Tris 和 1 mM EDTA, pH 8.0)。 如果继续执行步骤 2.2 (使用基于转座机的碎片和快速测序工具), 请添加200Μl 的 10 mm Tris (pH 8.0) 和 0.02% triton X-100。注: 请勿打扰 DNA 颗粒。让管处于4°c 的黑暗48小时将有助于样品完全重新悬浮。HMW DNA 可在4°c 下保存长达2周。较长的存储时间或其他存储条件可能会引入更多较短的碎片。 2. 超长 DNA 文库建设 注: 有两种方法来构建超长 DNA 库基于两种不同的剪切方法与纳米粒子测序试剂盒相结合。基于机械剪切的库生成的数据为 50-70 kb 的 N50, 用于图书馆建设大约需要8小时。基于转位数据库片段的库生成的 N50 为 90-100 kb 数据, 仅需90分钟进行库构建。机械剪切协议使用相同版本的测序适配器和纳米孔流动细胞的质量, 从相同的 DNA 输入中获得更高的产量。 基于机械剪力的图书馆建设 解冻并混合结扎试剂盒中的试剂 (见材料表)。解冻 FFPE DNA 修复缓冲液和结束修复–尾矿缓冲液在冰上, 然后涡旋和旋转下混合。解冻适配器混合 (AMX) 和适配器珠子绑定缓冲器 (ABB) 在冰上, 然后移液器和旋转下来混合。在 RT 中用燃料混合 (RBF) 和洗脱缓冲液 (ELUTION) 解冻运行缓冲器, 然后涡旋和旋转下混合。解冻库在 RT 装载珠子 (LLB) 和移液器, 在使用前混合。 解冻后, 将所有套件组件放在冰上。只有在需要的时候才会取出酶。将磁珠带到 RT 使用。注: 有关要使用的磁珠的建议, 请参见材料表。 从步骤1.21.1 检查 HMW DNA 的质量和数量。从 Hmw DNA 管中的三个不同位置使用 P200 宽孔提示将20Μl 的 DNA 输送到新的 1.5 mL 管中。取三个等价物中的 1Μl, 使用荧光计检测浓度, 用 uv 读数检测质量。多次检查以确认结果。注: 预期结果如图 3 a所示。OD2600280 值大约为 1.9, od26/230 值约为2.3。 将剩余的 940μl HMW DNA 转移到具有 P1000 宽孔尖端的50毫升管盖中。 将所有 DNA 吸入1毫升注射器, 无需针头。 将 27 G 针放入注射器上, 轻轻地将所有 DNA 缓慢 (~ 10秒) 喷射到瓶盖中。从注射器上取下 27 G 针。 重复步骤2.1.4 和 2.1.5 29次, 共30次通过针头。注: 剪切的 HMW DNA 可在4°C 的黑暗中储存长达 24小时. 脉冲场凝胶电泳强烈建议进行质量控制 (QC), 但成本高、耗时长。如果在自动脉冲场凝胶电泳机上执行 QC, 使用5-150kb 协议跑20小时。预期的结果如图 4所示。 在 0.2 mL 管中加入100Μl 的剪切 HMW DNA (20μg)、15μl 的 FFPE DNA 修复缓冲液、12μl 的 FFPE dna 修复混合物和16μl 的无核水, 准备 DNA 修复反应。将反应混合, 轻轻闪烁 6次, 然后向下旋转以去除气泡。 在20°c 下将反应加氢 60分钟, 将样品转移到带有 P200 宽孔尖端的新 1.5 mL 管中。 通过移液或涡旋重新扫描磁珠。在 DNA 修复反应中加入143μl 珠 (1x), 轻轻搅拌6次。在 RPM 晚上20转旋转旋转搅拌机上旋转管30分钟。 在 RT 以 1, 000 x x 克的速度将样品向下旋转, 在磁性机架上放置 10分钟. 将管子放在磁性机架上, 并丢弃上清液。 将管子放在磁性机架上, 在不干扰颗粒的情况下, 加入400Μl 的新鲜制备的70% 乙醇。30秒后去除70% 的乙醇。 重复步骤2.1.11 一次。 在 RT 以 1, 000 x克的速度将样品向下旋转 2秒, 将管子放回磁性机架上。去除任何残留的乙醇和空气干燥30秒。不要把颗粒擦干。 从磁性机架上取下管, 加入103Μl 的 TE (10 mM Tris 和 1 mM EDTA, pH 值 8.0)。轻轻轻触试管, 确保珠子被覆盖在缓冲液中, 并在 RT 的旋转搅拌机上孵育 30分钟. 每5分钟轻轻轻拍一次管, 以帮助颗粒重新悬浮。 将磁架上的珠子颗粒至少 10分钟. 用 P200 宽孔尖端将100μl 的洗脱液转移到 0.2 mL 管中。 在 0.2 mL 管中加入100Μl 的修复 HMW DNA、14μl 的端部修补-尾矿缓冲液和7μl 的端部修补尾矿混合, 在 0.2 ml 管中制备端部修复和 Da-tha玲反应。通过轻轻闪烁6次混合反应, 然后向下旋转以去除气泡。 在20°c 下将反应培养 60分钟, 然后再在65°c 中培养 20分钟, 然后保持在22°C。使用 P200 宽孔尖端将样品转移到新的 1.5 mL 管中。 通过移液或涡旋重新扫描磁珠。在末端修复-尾部反应中加入48μl 的珠子 (0.4倍), 然后轻轻搅拌, 将试管轻弹6次。在 RPM 晚上20转旋转旋转搅拌机上旋转管30分钟。 重复步骤 2.1.10-2.1.13 一次。 从磁性机架上取下管, 加入33Μl 的 TE (10 mM Tris 和 1 mM EDTA, pH 值 8.0)。轻轻轻触试管, 确保珠子被覆盖在缓冲液中, 并在 RT 的旋转搅拌机上孵育 30分钟. 每5分钟轻轻轻拍一次管, 以帮助颗粒重新悬浮。 将磁架上的珠子颗粒至少 10分钟. 用 P200 宽孔尖端将30μl 的洗脱液输送到新的 1.5 mL 管中。取额外的1-2 μL, 使用荧光计检测浓度。注: 预计在此步骤中恢复5-6 微克。 在 1.5 mL 样品管中加入30Μl 的端修复 HMW DNA, 20μl 的适配器混合 (AMX 1D), 并加入50μl 的福音结扎主混合物, 准备结扎反应。混合反应, 在每个连续加法之间轻轻闪烁 6次, 并向下旋转以去除气泡。 在 RT 中培养反应60分钟。 通过移液或涡旋重新扫描磁珠。在结扎反应中加入40Μl 珠 (0.4 x), 轻轻搅拌6次。在 RPM 晚上20转旋转旋转搅拌机上旋转管30分钟。 重复步骤2.1.10 一次。 在管中加入400Μl 的适配器珠结合 (ABB) 缓冲器。轻轻轻扫管 6次, 重新悬挂珠子。将管子放回磁性机架上, 将珠子与缓冲器分开, 并丢弃上清液。 重复步骤2.1.26 一次。 在 RT 以 1, 000 x克的速度将样品向下旋转 2秒, 将管子放回磁性机架上。取出任何残留的缓冲液, 并将空气干燥30秒。不要把颗粒擦干。 从磁性机架上取下管子, 然后在43μl 洗脱缓冲液中重新悬浮颗粒。轻轻轻触试管, 确保珠子被覆盖在缓冲液中, 并在 RT 旋转搅拌机上孵育 30分钟. 每5分钟轻轻轻触管, 以帮助颗粒重新悬浮。 将磁架上的珠子颗粒至少 10分钟. 用 P200 宽孔尖端将40μl 的洗脱液转移到新的 1.5 mL 管中。取额外的1-2 μL, 使用荧光计检测浓度。注: 预计在此步骤中恢复1-2 微克。基于机械剪切的库已准备好加载。该库可以在冰上存储长达 2小时, 直到加载进行排序 (如果需要)。 基于转移式碎片的图书馆建设 从转座酶试剂盒中解冻试剂 (见材料表)。解冻破碎混合 (FRA) 和快速适配器 (RAP) 在冰上和移液器混合。解冻测序缓冲液 (SQB), 加载珠子 (LB), 冲洗缓冲液 (FLB) 和冲洗系绳 (FLT) 在 RT 和移液器混合。在 RT 上装载珠子 (LB), 在使用前混合。解冻后, 将所有套件组件放在冰上。只有在需要的时候才会取出酶。 从步骤1.21.2 检查 HMW DNA 的质量和数量。从 Hmw DNA 管中的三个不同位置使用 P200 宽孔提示将20Μl 的 DNA 输送到新的 1.5 mL 管中。取三个等价物中的 1Μl, 使用荧光计检测浓度, 用 uv 读数检测质量。多次检查以确认结果。注: 预期结果如图 3 b所示。OD2600280 值大约为 1.9, od26/230 值约为2.3。 在 0.2 mL 管中加入22Μl 的 HMW DNA, 10mm Tris (pH 8.0) 的 1Μl, 并加入0.02% 的 Triton X-100 和1μl 的碎裂混合物 (FRA), 在 0.2 ml 管中制备 DNA 标记反应。通过与 P200 宽孔尖的移液混合尽可能缓慢 6次, 注意不要引入气泡。 在30°c 下将反应培养 1分钟, 然后在80°c 下培养 1分钟, 然后在4°c 下保持。将混合物转移到一个新的 1.5 mL 管与 P200 宽孔提示, 并立即进入下一步。 在 1.5 mL 样品管中加入1μl 快速适配器 (RAP)。通过与 P200 宽孔尖的移液混合尽可能缓慢 6次, 注意不要引入气泡。 在 RT 中培养反应60分钟。注: 基于转储碎片的库已准备好加载。该库可以在冰上存储长达 2小时, 直到加载进行排序 (如果需要)。 3. 纳米孔装置上的测序 检查纳米粒子测序装置 (参见材料表)。确保软件和硬件都正常工作, 并且有足够的存储空间。 检查流动单元。打开一个新的流动单元, 并将流动单元插入纳米孔设备。选中流单元插入到的位置 (X1-x5) 的框。选择正确的流单元格类型。单击 “检查流单元格” 工作流.单击 “开始测试”按钮, 开始流单元 qc 分析。注: 如果报告的总活动孔数小于 800, 请使用不同的新流动单元进行测序。 准备启动缓冲区。对于基于机械剪切的文库, 在 1.5 mL 管中加入576μl 的运行缓冲液 (RBF) 和624μl 的无核酸酶水。涡流和旋转向下混合启动缓冲液。对于基于转座片碎片的库, 在冲洗缓冲液 (FLB) 管中加入30Μl 的冲洗系 (FLT)。涡流和旋转向下混合启动缓冲液。 在流动单元上, 顺时针移动启动端口盖, 以暴露启动端口。 将 P1000 移液器设置为 100μl, 并将尖端插入启动口。减少少量的缓冲液 (小于 30μl), 从流动单元中取出任何气泡。一旦少量黄色液体进入尖端, 就停止移液。 使用 P1000 移液器通过启动口将启动混合物的800μl 加载到流动单元中。为避免引入气泡, 请先添加30Μl 的启动混合物以覆盖启动口的顶部, 然后将尖端插入启动端口, 然后慢慢添加其余的启动混合物。当剩下大约50Μl 时, 取出尖端。在启动口的顶部添加其余的启动混合物。液体会自行进入体内。 让设置孵育5分钟。同时, 在包含库的 1.5 mL 管中准备库组合。注: 对于基于机械剪切的库, 在 dna 库的40Μl 中添加35Μl 的带有燃料混合 (RBF) 的运行缓冲液。对于基于转座酶片段的文库, 在 dna 文库中添加34Μl 测序缓冲液 (SQB) 和16μl 无核水。 轻轻打开流单元样品端口盖, 露出样品端口。如步骤3.5 中所述, 使用 P1000 移液器通过启动口将启动混合物的200Μl 添加到流动单元中。确保启动混合物不会通过样品端口加载到流动单元中。 将 P200 移液器设置为80μl。只需在加载前向上和向下移液 6次, 将库与宽孔尖端轻轻混合。 通过采样端口将库混合向下加载到流单元中。只有在上一个放置完全加载到端口后, 才添加每个放置。 轻轻地将样品口盖放回原处, 确保样品口完全覆盖。逆时针移动启动端口盖, 以覆盖启动端口。合上设备盖。 单击”新实验” 工作流。键入库名称, 根据使用的过程选择正确的套件, 并检查设置是否正确 (48小时运行, 实时基本调用 ON)。 单击 “开始运行”。10分钟后, 从运行信息中记录流动单元 ID 和活动纳米孔数 (总数和每四个组的数字)。 数据分析。在排序的任何时候或运行完成时, 将数据复制到本地计算机或群集。使用 Minimap2 16 (https://github.com/lh3/minimap2) 将序列数据与参考基因组对齐。用 NanoPlot 17 (Https://github.com/wdecoster/NanoPlot) 从原始序列数据和对齐中总结了测序性能。