化学抑制剂库筛选 t 细胞受体信号的中介识别

在这项研究中, 使用了6至8周大的雄性和雌性 c57bl 6只小鼠。这些老鼠是在新加坡国立大学 (新加坡) 的动物设施中繁殖的。新加坡国立大学动物护理和使用机构委员会 (iacuc) 批准了所有动物实验。 1. 胸腺细胞悬浮液的制备 在二氧化碳室里对老鼠进行安乐死。 在组织培养罩中执行后续步骤, 以避免细胞培养物受到任何污染。用针脚将鼠标尸体固定在解剖板上, 并向鼠标喷洒70% 的乙醇。 用一把剪刀, 在腹侧做一个垂直切口, 从腹部到下巴。沿着每条后腿做进一步的切口。伸展皮肤, 露出肋骨, 并将其固定下来。 用剪刀将隔膜和肋骨的两侧从后端剪下来。提起肋骨笼, 并将其固定下来, 以暴露胸腺。分离附着在胸腺上的结缔组织, 并使用一对弯曲的钳子提取胸腺。 将胸腺放入一个6孔板的井, 其中包含5毫升的完整 rpmi 介质。注: 考虑添加10% 的带字符的胎儿牛血清 (fbs) 培养基, 以提高胸腺细胞的活力, 如果预计在解剖和刺激试验之间的等待时间很长。 用注射器的钝器轻轻捣碎胸腺, 并通过70μm 细胞过滤器将细胞穿过。或者, 要在更健康的条件下收集胸腺细胞, 可以考虑使用两对钳子挤压胸腺, 并收集从胸腺上皮流出的胸腺细胞。 使用血细胞计或任何自动细胞计数仪进行细胞计数。 2. 激酶抑制剂对无毒浓度的滴定 注: 本节重点介绍准备用于 t 细胞活化屏幕的抑制剂。在高浓度下使用的抑制剂会导致细胞死亡, 这是对 t 细胞激活屏幕的读出。一系列的稀释剂旨在确定不应该诱导细胞凋亡独立于 tcr 刺激的个别抑制剂的最终浓度。本研究中使用的激酶抑制剂库是从外部供应商处购买的。抑制剂的清单包括在材料表中。 低浓度激酶抑制剂板的制备 在 1 mm 的情况下制备一盘抑制剂, 在所有抑制剂的90μl 二甲基亚硫醚 (dmso) 中加入10μl 的抑制剂。注: 本研究中使用的小分子库中的抑制剂的库存浓度为 10 mm。如果抑制剂是颗粒形式, 请按照供应商建议的重组步骤进行。如果抑制剂没有在 10 mm 提供, 则以替代适当的浓度制备抑制剂板, 并制备具有适当稀释因子的抑制剂的单独系列稀释。注意: 在有毒抑制剂的情况下, 请遵循制造商关于安全处理和处置的说明。 在 0.1 mm 的情况下制备阻剂板, 在 dmso 中加入 1 mm 抑制剂板中的10μl 抑制剂。 在 0.01 mm 的情况下制备阻剂板, 在 dmso 中加入 0.1 mm 抑制剂板中的10μl 抑制剂。 激酶抑制剂治疗胸腺细胞 根据第1节准备胸腺细胞悬浮液。 将胸腺细胞稀释在完全 rpmi 中, 获得 5 x10 6 细胞的胸腺细胞悬浮液。 使用多通道移液器, 将胸腺细胞悬浮液添加到96孔板的所有井中。 在每口井中, 从含有 1 mm 抑制剂的板材的相应井中加入2μl 的抑制剂 (抑制剂的最终浓度为 10μm)。 在同一板块中, 通过添加 2μl dmso, 制备四口未经处理的控制井、四口5μm 地塞米松处理的阳性对照井和四口经过车辆处理的负控制井。 将胸腺细胞孵育 37°c, 5% co2孵化器 17-20小时 (或过夜)。 个别抑制剂适当浓度的测定 将胸腺细胞板在 300 x g和4°c 下旋转 5分钟, 将细胞重新移植到25μl 的流式细胞仪洗涤缓冲液中。 运行流式细胞仪分析样品, 并使用流式细胞仪分析程序对结果进行分析。 根据 fsc-ssc 门控确定活细胞的百分比。门控策略如图 1 b 所示。 根据 dmso 处理的控件计算活细胞的平均百分比, 这些控件的归一化为100%。设置可接受细胞死亡的任意窗口 (例如, 12.20%)。导致活细胞低于此窗口的百分比的抑制剂 (即低于 dmso处理过的控制的 80%) 将在较低的浓度下再次进行测试。 对于未在步骤2.3.4 中通过生存能力标准的抑制剂, 重复步骤 2.2.1-2.3.4, 但使用 0.1 mm 的抑制剂板进行步进2.2.4 而不是含有 1 mm 抑制剂的板。这里使用的抑制剂的最终浓度为1μm。 对于仍能在1μm 下产生高水平细胞死亡的抑制剂, 在0.1μm 时测试抑制剂, 重复步骤 2.2.1-2.3.4, 但在 0.01 mm 的情况下, 2.2.4 使用 0.01 mm 的抑制剂板。这里使用的抑制剂的最终浓度为0.1μm。 激酶抑制剂的制备 对于要在10μm 下使用的抑制剂, 在 10μl dmso 中加入10μl 的 10μl 10 mm 抑制剂。 对于在1μm 下使用的抑制剂, 在19μl 的 dmso 中加入1μl 的 10 mm 抑制剂。 对于在0.1μm 下使用的抑制剂, 在199μl 的 dmso 中加入1μl 的 10 mm 抑制剂 (图 1c)。注: 制备的抑制剂库存板是在胸腺细胞悬浮液中添加的预期最终浓度的500x。抑制剂的股票板可以在 pcr 条或96孔板中制备。 激酶抑制剂的股票板可应用于胸腺细胞, 以便在传统的离心依赖系统中进行筛选 (第3节; 见图 1a, 方法1和 2), 也可应用于与离心无关的替代系统 (第4节; 见图 1a, 方法 3)。 3. 激酶抑制剂图书馆筛选 (常规离心法分析) 激酶抑制剂治疗胸腺细胞 根据第1节准备胸腺细胞悬浮液。 将胸腺细胞稀释在完全 rpmi 中, 获得 5 x10 6 细胞的胸腺细胞悬浮液。 使用多通道移液器, 将200μl 的胸腺细胞添加到96孔板的每一口井中。把盘子放在冰上。 从第2.4 节制备的抑制剂板的相应井中加入0.5μl 的抑制剂。 准备8口未经处理的控制井。通过添加0.5μl 的 dmso, 准备四口经过车辆处理的控制井。准备四口5微米地塞米松处理控制的井 (图 2)。 抗 cd驻28微珠刺激胸腺细胞 取1毫升珠子, 用2毫升的 pbs 清洗珠子。使用磁性支架分离珠子, 并吸入溶液。将珠子重新用于5毫升的完整 rpmi 中。注: 珠子与细胞的比率为1比2.5。根据要刺激的井的数量和使用的胸腺细胞的数量, 调整要吃的珠子的数量。 在每个经抑制剂处理的样品、4个 dmso 处理的样品和8个未经处理的样品中添加50μl 珠子。在剩余的四口未经处理的油井中加入50μl 的完整 rpmi。图 2显示了板材的总体布局。 使用多通道移液器混合井的内容物。 将胸腺细胞孵育 37°c, 5% co2孵化器 17-20小时 (或过夜)。 表面抗原的染色 制备含有抗 tcrβ、抗 cd4、抗 cd8 和抗 cd69 抗体的抗体染色混合物。在 facs 洗涤缓冲液中稀释抗体 (pbs 补充0.5% 的牛血清白蛋白 [bsa]), 比例为 1:200 (v/v)。注: 考虑优化用于染色的抗体滴度, 而不是使用固定抗体稀释剂, 以最大限度地减少不同实验中染色的变化, 并提高信噪比。 将板材旋转到300 x g和 4°c, 5分钟。 轻扫板以丢弃溶液。 此时, 该协议可以遵循传统的与离心相关的协议 (继续执行步骤 3.3.5; 参见图 1a, 方法 1) 或与离心有关的替代协议 (继续执行步骤 4.4.4; 请参见图 1a, 方法2)。 在步骤3.3.1 制备的染色抗体混合物的75μl 中重新移植细胞。 用多通道移液器混合样品, 在冰上孵育 3 0分钟。 固定细胞 用200μl 的流式细胞仪清洗井, 在 300 x g和4°c 下旋转板, 5分钟。 轻扫板以丢弃溶液。 加入固定-渗透缓冲液 (随活性酪蛋白-3 凋亡试剂盒一起; 与步骤3.5.1 中提到的 10倍 perm/dhuthasuber 和步骤3.5.2 的抗 caspase-3 抗体相同), 每口200μl。 在冰上孵化30分钟。 活性酪蛋白3的细胞内染色 在45毫升的超纯水中稀释5毫升的 10x perm/wash 洗涤缓冲液, 制备 1x perm从洗缓冲液。 在 1x perm2 洗缓冲液的 6.5 ml 中加入 1.3 ml 抗卡斯帕塞-3 抗体, 制备细胞内活性酪蛋白酶染色。抗体与洗液缓冲液的比例为1:5。 将板材旋转到 300 x g和 4°c, 5分钟内滑动板丢弃溶液。用 1x perm1 洗缓冲液清洗板200μl。 重复步骤3.5.3。 将板材旋转到 300 x g和 4°c, 5分钟内滑动板丢弃溶液。在所有井3.5.2 加入步骤制备的细胞内酪蛋白酶染色75μl。 用多通道移液器混合样品, 在冰上孵育1小时。 用200μl 的 1x perm/washkashbashbashel 清洗样品, 并在 300 x g和4°c 下旋转板, 时间为5分钟。 轻扫板以丢弃溶液。用 1x perm1 洗缓冲液清洗板200μl。将板材旋转到300 x g和 4°c, 5分钟。 轻按板材丢弃溶液, 然后在200μl 的流式细胞仪洗涤缓冲液中重新悬浮样品。 运行样品的流式细胞仪分析, 并使用流式细胞仪分析程序对结果进行分析。 使用 cd4与cd8 图, 在 dp 胸腺细胞的种群上进行门, 并有 cd4 和 cd8 的阳性表达 (图 2, 下半部分)。在 dp 胸腺细胞门内, 以无刺激样品为阴性对照, 地塞米松为阳性对照, 测定活化卡斯帕西-3 细胞的百分比。为分析 cd69 在 dp 胸腺细胞门中的表达, 以未受激样本为阴性对照, 以受激样本为阳性对照。注: 在 dp 胸腺细胞上浇注时, 验证单个样本的 dp 胸腺细胞的数量是否正确地门控。被刺激的细胞向下调节表面受体, 如果使用紧密的 dp 门, 可能会意外排除事件。 4. 激酶抑制剂图书馆筛选 (离心独立检测) 激酶抑制剂治疗胸腺细胞 根据第1节准备胸腺细胞悬浮液。 稀释完全 rpmi 中的胸腺细胞, 获得 25 x10 6 细胞的胸腺细胞悬浮液。 使用多通道移液器, 将胸腺细胞加入 40μl, 加入小体积板的每口井中。把盘子放在冰上。 将总盘、dmso 和地塞米松中的抑制剂稀释为完全 rpmi, 比例为全 rpmi 的四个部分, 与抑制 dmsow-地塞米松 (稀释系数为 5) 的比例。注: 由于这个小体积板使用的体积比传统方法小 5倍, 抑制剂和控制试剂在加入板的胸腺细胞之前被稀释了五倍。 从步进4.1.4 制备的阻托板相应井中, 在96孔板中加入0.5μl 的抑制剂。 准备8口未经处理的控制井。通过添加步进4.1.4 制备的 dmso 的 0.5μl, 准备四口经过车辆处理的控制井。准备四口5微米地塞米松处理控制, 使用步骤4.1.4 制备的稀释地塞米松 (图 2)。 抗 cd驻28微珠刺激胸腺细胞 确保珠子均匀地重新悬浮。取1毫升珠子, 用2毫升的 pbs 清洗。使用磁性支架分离珠子, 并吸入溶液。将珠子重新用于1毫升的完整 rpmi 中。注: 珠子与细胞的比率为1比2.5。根据要刺激的井的数量和使用的胸腺细胞的数量, 调整珠子的数量。 在每个经抑制剂处理的样品、4个 dmso 处理的样品和8个未经处理的样品中添加10μl 的珠子悬浮液。在剩余的四口未经处理的油井中加入10μl 的完整 rpmi。图 2显示了一般的板布局。注: 井的最终体积为 50μl, 在井的最大容量范围内。重要的是要谨慎行事, 并保持板直立, 以避免交叉井溢出。 要混合, 使用微板轨道振动台搅拌板。或者, 使用多通道移液器混合井的内容物。 用抗蒸发盖将胸腺细胞孵育 37°c, 5% co 2 孵化器 17-20小时 (或过夜)。 板式垫圈的设置注: 设置板式垫圈的说明由制造商提供。下文简要介绍了这些步骤。每个启动步骤大约需要150毫升的解决方案。 用含有1% 特温20的70% 乙醇清洗系统。 用含有1% 补间20的去离子水清洗系统。 使用流式细胞仪清洗缓冲液提供清洗系统。 表面抗原的染色 制备含有抗 tcrβ、抗 cd4、抗 cd8 和抗 cd69 抗体的抗体染色混合物。以 1:100 (v2) 的比例稀释流式细胞仪洗涤缓冲液中的抗体。 清洗板 9x, 使用55μl 的流式细胞仪清洗缓冲液每次清洗, 使用自动层流清洗系统。注: 在洗涤结束时, 每口井的剩余体积为25μl。 在步骤4.4.1 制备的染色抗体混合物中, 将细胞重新移植到25μl 中。 如果样品从96孔板 (从步骤 3.3.4) 转移, 将细胞重新悬浮在步骤3.3.1 制备的抗体混合物50μl 中, 然后将样品转移到小体积板。此步骤对应于方法编号 2, 如图 1 a所示。 要混合, 用微板轨道振动台搅拌板, 或使用多通道移液器混合样品, 并在冰上孵育 3 0分钟。 固定细胞 清洗板 9x, 使用55μl 的流式细胞仪清洗缓冲液每次清洗, 使用自动层流清洗系统。 加入固定-渗透缓冲液 (随活性酪蛋白-3 凋亡试剂盒一起; 与步骤4.6.1 中提到的 10倍 perm/dhuthasuber 和步进4.6.2 的抗卡斯帕塞-3 抗体相同), 每口每口50μl。 在冰上孵化30分钟。 活性酪蛋白3的细胞内染色 在225毫升的超纯水中稀释25毫升的 10x perm/wash 洗涤缓冲液, 制备 1x perm从洗缓冲液。 在 1x perm2 洗缓冲液的2毫升中加入 1 ml 抗卡斯帕塞-3 抗体, 制备细胞内活性酪蛋白酶染色。抗体与洗液缓冲液的比例为1:2。 使用 1x perm·洗涤缓冲液来冲洗系统。 用1x 的 perm/洗净缓冲液清洗板 9x, 每次清洗时为55μl。 在所有井4.6.2 加入步骤制备的细胞内酪蛋白酶染色25μl。 要混合, 用微板轨道振动台搅拌板, 或使用多通道移液器混合样品, 在冰上孵育1小时。 用1x 的 perm/洗净缓冲液清洗板 9x, 每次清洗时为55μl。 在所有井中添加25μl 的流式细胞仪洗涤缓冲液。 通过移液充分混合后,将样品转移到微滴管中。 在气井中加入50μl 的流式细胞仪洗涤缓冲液, 并重复步骤4.6.9。 重复步骤 4.6.9, 4.6.10 2x, 直到在微滴定管中采集200μl 的样品。注: 步骤4.6.10 和4.6.11 中描述的过程的目的是确保细胞从小体积板中得到最大程度的恢复。如果不考虑细胞数量, 在4.6.10 步骤后, 只需使用流式细胞仪洗涤缓冲液将微滴管加满200μl 即可。 按照3.5.11 的步骤, 对样品进行流式细胞仪分析, 并使用流式细胞仪分析程序对结果进行分析。分析了含有 cd4+cd8+dp 胸腺细胞的闸门中的里海-3 活化和 cd69 表达。