Autoradiografia come un metodo semplice e potente per la visualizzazione e caratterizzazione di bersagli farmacologici
Özet
Il metodo di autoradiografia è ordinariamente utilizzato per studiare l’associazione di radioligands per sezioni di tessuto per la determinazione qualitativa o quantitativa farmacologia.
Abstract
In vitro l’autoradiografia ha lo scopo di visualizzare la distribuzione anatomica di una proteina di interesse nel tessuto da animali da esperimento come pure gli esseri umani. Il metodo si basa sul legame specifico di un radioligand al suo target biologico. Pertanto, le sezioni di tessuto congelato sono incubate con radioligandi soluzione e l’associazione alla destinazione è successivamente localizzata tramite la rilevazione del decadimento radioattivo, ad esempio, utilizzando la pellicola fotosensibile o fosforo piastre di imaging. Autoradiogrammi digitale risultante visualizzare notevole risoluzione spaziale, che consente la quantificazione e la localizzazione di radioligand binding in strutture anatomiche distinte. Inoltre, quantificazione consente la caratterizzazione farmacologica di affinità ligando mediante costanti di dissociazione (Kd), costanti di inibizione (Kio) così come la densità di siti di legame (Bmax) in determinati tessuti. Così, il metodo fornisce informazioni sulla localizzazione di destinazione sia selettività ligando. Qui, la tecnica è esemplificata con autoradiografico caratterizzazione dell’acido ad alta affinità γ-idrossibutirrico (GHB) siti nel tessuto di cervello dei mammiferi, con speciale enfasi su considerazioni metodologiche per quanto riguarda l’analisi obbligatoria di legame parametri, la scelta del radioligand e il metodo di rilevamento.
Introduction
Autoradiografia è un metodo che fornisce immagini di decadimento radioattivo. La tecnica è usata ordinariamente per studiare la distribuzione tissutale di una proteina di interesse in vitro basato su una specifica interazione farmacologica tra un composto radiomarcato e l’obiettivo. Questo fornisce informazioni dirette circa la selettività del ligando per la destinazione. Autoradiografia in vitro può essere utilizzato anche per la determinazione quantitativa di parametri di associazione farmacologica di radioligands, come la costante di dissociazione (Kd) e densità di siti di legame (Bmax), nonché per la determinazione la costante di inibizione (Ki) delle concorrenti ligandi1,2. Rispetto al tradizionale omogeneato radioligand binding, autoradiografia ha il vantaggio di essere in grado di visualizzare anatomia spaziale e con l’indicazione succinte della espressione regionale modelli3. Il metodo di autoradiografia è quindi un’alternativa pertinente per immunocitochimica, soprattutto in assenza di un anticorpo convalidato. Autoradiografia viene implementata facilmente in un laboratorio del radioisotopo standard dato la disponibilità di un radioligand adatto con la necessaria specificità farmacologica, ad un criostato microtomo per la preparazione di sezioni di tessuto e un imaging adatto dispositivo che è in grado di analizzare la distribuzione della radioattività nelle sezioni rispettive del tessuto. In particolare, un importante criterio di selezione per il radioligando è una quantità limitata di associazione ai siti non-bersaglio. Questo può essere ad altre proteine, membrane o materiali quali plastica o filtri ed è collettivamente come legame non specifico. Solitamente, il legame non specifico è non saturabile ma può essere saturabile se si tratta di una specifica proteina fuori bersaglio. Il modo migliore di convalida vero legame specifico è da confrontare con tessuti manca il bersaglio, per esempio, geneticamente ingegnerizzati (knock-out) del tessuto4.
Qui, la metodologia è illustrata con la caratterizzazione autoradiografica del sito di legame ad alta affinità per l’acido γ-idrossibutirrico (GHB) nel cervello dei mammiferi. Comprendere l’interazione farmacologica tra GHB e il suo sito di legame è di pertinenza come GHB è una droga sia clinicamente utile nel trattamento della narcolessia e alcolismo5, ma anche un costituente naturale del cervello dei mammiferi e un’area di divertimento droga6. Siti di legame ad alta affinità GHB in primo luogo sono stati descritti utilizzando [3H] associazione di GHB a ratto cervello omogeneato7. Nel corso degli anni, ulteriori studi di autoradiografia con [3H] GHB e l’analogo [3H] NCS-382 ha mostrato un’alta densità di siti nelle regioni del forebrain del ratto8,9,10, mouse9 di legame ,11e scimmia/umano cervello12del maiale. Tuttavia, l’identità molecolare ed esatta rilevanza funzionale di questi siti di legame sono rimasti sfuggente.
Con l’intenzione di caratterizzare ulteriormente i siti di legame e per facilitare gli studi sul ruolo fisiologico di GHB, sono state sviluppate più radioligands incorporando isotopi diversi dotati di diverse affinità ([3H] GHB, [3 H] NCS-382, [3H] HOCPCA e [125I] BnOPh-GHB)13,14,15,16(rivisto in17) (Figura 1). La combinazione di selettivo ad alta affinità radioligands e una densità molto elevata del tessuto dell’associazione siti hanno permesso per la produzione di immagini di alta qualità utilizzando il fosforo imaging tecnica9,11. Insieme con un contorno dei punti pratici nella creazione di un esperimento autoradiografico e un’illustrazione per esemplificare i dettagli, la sezione di discussione metterà in risalto i) la scelta di radionuclide, ii) la scelta delle condizioni di dosaggio e iii) l’uso del fosforo Imaging piastre contro pellicola di raggi x. L’obiettivo generale di questa carta è quello di fornire dettagli tecnici, metodologici e scientifici sulla tecnica autoradiografia per informare sulla distribuzione tissutale e analisi farmacologica di bersagli proteici.
Protocol
Representative Results
Discussion
La qualità di un’analisi autoradiografica viene determinata dalla sensibilità del radioligand. Un fattore di contributo importante è il radioisotopo selezionato, che è dato dalla disponibilità di ligandi noti o dalla fattibilità di specifiche tecniche di etichettatura per produrre ligandi con appropriata attività specifica (cioè, la quantità di radioattività per mole unità un radioligando)23e con limitate quantità di degradazione chimica. Un gran numero di radioligands di liga…
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il lavoro è stato supportato dalla Fondazione Lundbeck (Grant R133-A12270) e la Fondazione di Novo Nordisk (Grant NNF0C0028664). Gli autori ringraziano il Dr. Aleš Marek per la fornitura di radioligand [3H].
Materials
| Absolute ethanol | Merck Millipore | 107017 | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| BAS-TR2040 Imaging Plate | GE Healthcare Life Science | 28956481 | 20×40 cm – Sensitive to tritium |
| Cresyl violet acetate | Sigma-Aldrich | C5042-10G | |
| DPX (non-aqueous mounting medium for microscopy) | Merck Millipore | 100579 | |
| O.C.T. Compound, 12 x 125 mL | Sakura | 4583 | Tissue-Tek |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 16005-1KG-R | |
| Superfrost Plus slides | VWR | 631-9483 | microscope slides |
| Tissue-Tek Manual Slide Staining Set | Sakura Finetek Denmark ApS | 4451 | |
| Tritium Standard on Glas | American Radiolabeld Chemicals, Inc. | ART 0123 | |
| Xylene substitute | Sigma-Aldrich | A5597 |
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