Sondando a estrutura e a dinâmica de Nucleosomes usando imagem de microscopia de força atômica

Em células eucariontes, o DNA é altamente condensado e organizado em cromossomos. ¹ o primeiro nível de organização do DNA dentro de um cromossomo é o assembly de nucleosomes no qual 147 bp de DNA firmemente é acondicionada em torno de um núcleo de octamer de histona. ^{2 , 3} partículas nucleossoma montam sobre uma longa molécula de DNA, formando uma matriz de cromatina que é então organizada até uma unidade altamente compacto cromossomo é formada. ⁴ a desmontagem da cromatina fornece o acesso a livre DNA exigido pelo críticos processos celulares, tais como a replicação do genoma e a transcrição de genes, sugerindo que a cromatina é um sistema altamente dinâmico. ^{5 , 6 , 7} compreender as propriedades dinâmicas do DNA em vários níveis de cromatina é criticamente importante para elucidar os processos genéticos em nível molecular onde erros podem levar a morte celular ou o desenvolvimento de doenças como o câncer. ⁸ uma propriedade de cromatina de grande importância é a dinâmica dos nucleossomas. ^{9 , 10 , 11 , 12} a alta estabilidade destas partículas tem permitido a caracterização estrutural por técnicas cristalográficas. ² o que a falta desses estudos são os detalhes dinâmicos de nucleosomes tais como o mecanismo do DNA desembrulhar do núcleo de histona; o percurso dinâmico de que é necessário para os processos de transcrição e replicação. ^{7 , 9 , 13 , 14 , 15 , 16} além disso, as proteínas especiais denominadas fatores de remodelação foram mostradas para facilitar a desmontagem de partículas partícula¹⁷; no entanto, a dinâmica intrínseca da nucleosomes é o fator crítico neste processo que contribui para o processo de desmontagem inteira. ^{14 , 16 , 18 , 19}

Único-molécula técnicas como único-molécula fluorescência^19,20,21, captura óptica (pinças)^13,18,22,23 e AFM ^{10 , 14 , 15 , 16 , 24 , 25 , 26} ter sido instrumental na compreensão da dinâmica dos nucleosomes. Entre esses métodos, AFM beneficia de várias características originais e atraentes. AFM permite visualizar e caracterizar os nucleossomas individuais, bem como as matrizes mais²⁷. Imagens de AFM, características importantes da estrutura do nucleossoma tais como o comprimento do DNA enrolado em torno do núcleo de histona podem ser medido ^10,14,26,28; um parâmetro que é central para a caracterização da dinâmica desembrulhando nucleossoma. Passado o AFM estudos revelaram nucleosomes sistemas altamente dinâmicos e que o DNA pode espontaneamente desembrulhar o núcleo de histona¹⁴. O desempacotamento espontânea do DNA de nucleosomes foi visualizado diretamente pela AFM, operando no modo de lapso de tempo, quando a imagem é feita em soluções aquosas ^14,26,29.

O advento da instrumentação AFM (HS-AFM) Time-Lapse de alta velocidade, foi possível visualizar o processo desembrulhando nucleossoma no milissegundo de tempo-escala ^14,15,24. Recentes estudos de^{30 16,}HS-AFM de específico nucleosomes Centrómero revelaram várias características inovadoras dos nucleosomes comparados com o tipo canônico. Os nucleossomas Centrómero constituem-se de um centrômero, uma pequena parte do cromossomo criticamente importante para cromossomo segregação³¹. Ao contrário dos nucleosomes canônicos na cromatina em massa, o núcleo de histona de nucleosomes Centrómero contém histona CENP-A em vez de histona H3^32,33. Como resultado desta substituição de histona, envolvimento de DNA em nucleosomes Centrómero é ~ 120 bp em vez do ~ 147 bp para nucleosomes canônicos; uma diferença que pode levar a morfologias distintas do centrómero e canônicos nucleosomes matrizes³⁴, sugerindo que cromatina centrômero sofre maior dinâmica em comparação com o volume um. A dinâmica de novela exibida pela nucleosomes Centrómero em estudos de³⁰ HS-AFM^16,exemplificam a oportunidade única, fornecida por esta técnica de single-molécula Visualizar diretamente as propriedades estruturais e dinâmicas de nucleossomas. Exemplos desses recursos serão brevemente discutidos e ilustrados no final do livro. Este progresso foi feito devido ao desenvolvimento de novos protocolos para imagens de AFM dos nucleossomas, bem como as modificações de métodos existentes. O objetivo do protocolo descrito aqui é tornar esses avanços emocionantes em estudos de nucleossoma AFM único-molécula acessível a qualquer pessoa que gostaria de utilizar estas técnicas em suas investigações de cromatina. Muitas das técnicas descritas são aplicáveis a problemas além do estudo dos nucleosomes e podem ser usadas para investigações de outras proteínas e sistemas de DNA de interesse. Alguns exemplos de tais aplicações podem ser encontrados em publicações^{35,36,37,38,39,40,41, 42,43,44,45,46,47,48,49} e prospetos da estudos AFM de vários sistemas biomoleculares são dadas em clientes^29,50,,^51,53,54.