La struttura e la dinamica dei nucleosomi usando la formazione immagine di microscopia di forza atomica di sondaggio

Nelle cellule eucariotiche, il DNA è altamente condensata e organizzato in cromosomi. ¹ il primo livello di organizzazione del DNA all’interno di un cromosoma è l’Assemblea di nucleosomi in cui 147 bp di DNA è strettamente avvolto intorno ad un nucleo istonico istone. ^{2 , 3} particelle nucleosome montare su una lunga molecola di DNA che formano una matrice di cromatina che viene organizzata fino a formare un’unità estremamente compatta del cromosoma. ⁴ il disassemblaggio della cromatina fornisce l’accesso per liberare il DNA richiesto dalla critici processi cellulari quali la replica di genoma e trascrizione genica, suggerendo che quella della cromatina è un sistema altamente dinamico. ^{5 , 6 , 7} comprendere le proprietà dinamiche del DNA a vari livelli di cromatina è criticamente importante per il delucidamento processi genetici a livello molecolare, dove gli errori possono portare alla morte delle cellule o lo sviluppo di malattie come il cancro. ⁸ una proprietà della cromatina di grande importanza è la dinamica dei nucleosomi. ^{9 , 10 , 11 , 12} l’alta stabilità di queste particelle ha permesso per la caratterizzazione strutturale mediante tecniche cristallografiche. ² quali mancanza di questi studi sono unwrapping dal nucleo dell’istone; i dettagli dinamici di nucleosomi come il meccanismo del DNA il percorso dinamico di cui è necessario per i processi di trascrizione e replicazione. ^{7 , 9 , 13 , 14 , 15 , 16} inoltre, speciali proteine chiamate fattori di rimodellamento sono stati indicati per facilitare lo smontaggio di particelle nucleosomal¹⁷; Tuttavia, la dinamica intrinseca dei nucleosomi è il fattore critico in questo processo che contribuisce al processo intero smontaggio. ^{14 , 16 , 18 , 19}

Tecniche di singola molecola come singola molecola fluorescenza^19,20,21, intrappolamento ottico (pinzette)^13,18,22,23 e AFM ^{10 , 14 , 15 , 16 , 24 , 25 , 26} sono stati strumentale nella comprensione delle dinamiche di nucleosomi. Tra questi metodi, AFM beneficia di diverse caratteristiche uniche e interessanti. AFM permette di visualizzare e caratterizzare singoli nucleosomi, nonché il più lungo di matrici²⁷. Dalle immagini AFM, caratteristiche importanti della struttura del nucleosoma ad esempio la lunghezza del DNA avvolto intorno al nucleo dell’istone possono essere misurati ^10,14,26,28; un parametro fondamentale per la caratterizzazione della dinamica unwrapping nucleosoma. Passato AFM studi hanno rivelato nucleosomi per essere sistemi altamente dinamici e che il DNA può spontaneamente unwrap dal nucleo dell’istone¹⁴. L’unwrapping spontanea del DNA da nucleosomi direttamente è stato visualizzato da AFM di funzionamento in modalità Time-lapse quando l’imaging avviene in soluzioni acquose ^14,26,29.

L’avvento della strumentazione ad alta velocità Time-lapse AFM (HS-AFM) ha permesso di visualizzare il processo unwrapping nucleosoma al millisecondo scala tempo ^14,15,24. Recenti studi di^{30 16,}HS-AFM di nucleosomi specifico centromero ha rivelato parecchie caratteristiche romanzo dei nucleosomes rispetto al tipo canonico. Nucleosomi centromero si costituiscono di un centromero, una piccola parte del cromosoma criticamente importante per cromosoma segregazione³¹. A differenza dei nucleosomi canonici nella cromatina di massa, il nucleo dell’istone di nucleosomi centromero contiene istone CENP-A invece di istone H3^32,33. A seguito di questa sostituzione dell’istone, avvolgimento del DNA in nucleosomi centromero è ~ 120 bp invece la 147 ~ bp per canoniche nucleosomi; una differenza che può portare a diverse morfologie del centromero e canonici nucleosomi matrici³⁴, suggerendo che cromatina centromero subisce dinamica superiore confrontato con la maggior parte uno. La dinamica romanzo visualizzata da nucleosomi centromero negli studi di^{30 16,}HS-AFM esemplificano l’opportunità unica fornita da questa tecnica di singola molecola di visualizzare direttamente le proprietà strutturali e dinamiche di nucleosomi. Esempi di queste funzionalità saranno brevemente discusso e illustrati alla fine del libro. Questo progresso è stato effettuato a causa dello sviluppo di nuovi protocolli per formazione immagine AFM di nucleosomi, nonché le modifiche dei metodi esistenti. L’obiettivo del protocollo descritto qui è di rendere questi entusiasmanti progressi negli studi di singola molecola AFM nucleosoma accessibile a chiunque abbia voglia di utilizzare queste tecniche nelle loro indagini della cromatina. Molte delle tecniche descritte sono applicabili a problemi oltre lo studio dei nucleosomi e può essere utilizzati per indagini di altre proteine e DNA sistemi di interesse. Alcuni esempi di tali applicazioni possono essere trovati in pubblicazioni^{35,36,37,38,39,40,41, 42,43,44,45,46,47,48,49} e prospettive di AFM studi di vari sistemi biomolecolari sono date in recensioni^{29,50,51,53,54}.