原子力显微镜成像在核细胞结构和动力学研究中的应用

在真核细胞中, dna 高度凝聚并组织成染色体。¹染色体中 dna 组织的第一级是核糖体的组合, 其中 147 bp 的 dna 紧紧地包裹在一个组蛋白八分体核上。^2,3核糖体颗粒聚集在一个长的 dna 分子上, 形成一个染色质阵列, 然后组织起来, 直到形成一个高度紧凑的染色体单元。⁴染色质的分解提供了基因转录和基因组复制等关键细胞过程所需的免费 dna, 这表明染色质是一个高度动态的系统。^5,6,7了解 dna 在不同染色质水平上的动态特性对于阐明分子水平上的遗传过程至关重要, 因为在分子水平上, 错误可能导致细胞死亡或癌症等疾病的发展。⁸非常重要的染色质性质是核糖体的动力学。^9,10,11,12这些粒子的高稳定性使其能够通过晶体学技术进行结构表征。²这些研究缺乏的是核糖体的动态细节, 如 dna 从组蛋白核解包的机制;转录和复制过程所需的动态路径。^{7.,9,13,14,15,16}此外, 被称为重塑因子的特殊蛋白质已被证明有助于核糖体颗粒的分解¹⁷;然而, 核糖体的内在动力学是这一过程中的关键因素, 有助于整个拆卸过程。^14,16,18,19

单分子荧光技术, 如单分子荧光^19、20、21、光学捕获 (推子)^{13、18、22、23}和 afm^{10,14,15,16,24,25,26}在了解核糖体动力学方面发挥了重要作用。在这些方法中, afm 受益于几个独特而有吸引力的功能。afm 允许人们对单个核糖体以及较长的阵列27进行可视化和表征^.从 afm 图像中可以测量到组蛋白核周围的 dna 长度等核糖体结构的重要特征; 一个参数, 是核成体解包动力学的表征的核心。过去的 afm 研究表明, 核糖体是高度动态的系统, dna 可以自发地从组蛋白核14中展开。当成像在水溶液^14、26、29中进行时, afm 在延时模式下操作, 直接将 dna 从核糖体中解包出来。

高速延时 afm (hs-afm) 仪器的出现使得在毫秒时间尺度^14、15、24的时间尺度^上可视化核糖体展开过程成为可能。最近 hs-afm ^16,30研究的丝粒特异性核糖体揭示了几个新的特点的核糖体相比, 规范类型。中心核细胞组成的丝粒, 染色体的一小部分对染色体分离^{至关重要 31}。与块状染色质中的典型核糖体不同, 丝粒核糖体的组蛋白核心包含 cenp-a^组蛋白, 而不是组蛋白 h3^32,33。由于这种组蛋白取代, dna 包裹在丝粒核糖体中的是 ~ 120 bp, 而不是规范核糖体的 ~ 147 bp;这种差异可能导致着丝粒和规范核糖体数组34的不同形态, 这表明与块状染色体相比, 丝粒染色质经历了更高的动力学。在 hs-afm^16中,³⁰项研究所显示的新动力学说明了这种单分子技术为直接可视化其结构和动态特性提供了独特的机会。核糖体。本文最后将简要讨论和说明这些特点的例子。这一进展是由于开发了新的核糖体 afm 成像方案以及对现有方法的修改。这里描述的协议的目标是使这些令人兴奋的进展, 在单分子 afm 核糖体研究的任何人谁想要利用这些技术, 在他们的染色质调查。所描述的许多技术适用于核糖体研究以外的问题, 可用于研究其他感兴趣的蛋白质和 dna 系统。这些应用的几个例子可以在出版物^{35、36、37、38、39、40、41、 42、43、44、45、46、}47^{、48、49 和 afm}研究的前景各种生物分子系统在评论^{29,50,51, 53},^54给出了。