Diagnóstico de la enfermedad de Hirschsprung mediante biopsias de succión rectal Inmunostaining para calretinina, proteína S100 y producto genético de proteína 9,5
Özet
Este protocolo describe el proceso de inmunostaining de las biopsias de succión rectal para la calretinina, la proteína S100 y el producto genético de proteína 9,5. Este novedoso método de diagnóstico adyuvante para la enfermedad de Hirschsprung tiene tasas de sensibilidad y especificidad preferibles.
Abstract
La enfermedad de Hirschsprung (EH) es una enfermedad intestinal congénita que se manifiesta clínicamente como una incapacidad para pasar meconio en lactantes o como estreñimiento a largo plazo en niños. La biopsia de succión rectal (RSB) para determinar la ausencia de células ganglio y la hipertrofia neuronal es la prueba más precisa para el diagnóstico de la EH en la actualidad. La tinción de hematoxilina-eosina tradicional carece de sensibilidad y especificidad. La tinción de la acetilcolinesterasa no puede ser ampliamente utilizada debido a su complejo proceso. Nuestro novedoso protocolo de inmunostón para calretinina, proteína S100 y producto genético 9,5 (PGP 9.5), que realizamos en RSBs, exhibe tasas de alta sensibilidad y especificidad de 96,49% (intervalo de confianza de 95%, 0,88-0,99) y 100% (95% de confianza intervalo, 0,97-1.00), respectivamente. Los segmentos afectados por la EH a menudo se presentan como la ausencia de la expresión de calretinina, proteína S100, y PGP 9.5, que son marcadores de hipertrofia neuronal en el tejido submucosa. Este protocolo describe el proceso operativo detallado de este nuevo método de diagnóstico.
Introduction
La enfermedad de Hirschsprung (EH) es un trastorno intestinal congénita común caracterizado por la falta de células ganglionada en diferentes segmentos del tracto intestinal distal1. El sistema nervioso entérico humano se forma cuando se completa la invasión de las células neuronales embrionarias. Si hay una perturbación del proceso y la invasión no se completa, el intestino distal del recién nacido se convierte en aganglionic2. Esta afección potencialmente mortal se denomina enfermedad de Hirschsprung. La proliferación, la motilidad y el crecimiento intestinal son los tres componentes principales de la colonización exitosa.
La tinción de hematoxilina y eosina tradicional (H & E) de una biopsia submucosa limitada no puede alcanzar un resultado tan satisfactorio como la tinción de H & E de un tejido de espesor completo Obtenido de la cirugía. Adicionalmente, la acetilcolinesterasa (AChE) la tinción del tejido de succión rectal es teóricamente desafiante debido a su sensibilidad inadecuada, que es 91%, y el procesamiento complejo de las secciones congeladas3,4. Varios otros marcadores inmunohistoquímicos de células ganglionadas y fibras nerviosas que se pueden teñir en muestras fijas de formol y de parafina se están convirtiendo gradualmente en el principal diagnóstico de la EH. La calretinina es una proteína de unión al calcio dependiente de la vitamina D que no se expresa en el plexo mientérico y submucosa de los segmentos afectados por la EH5. La proteína S100 se expresa en células derivadas de la cresta neural, como las fibras nerviosas y las células gliales, que a menudo presentan hipertrofia neuronal en el tejido submucosa de los segmentos afectados por la EH6. El producto genético de proteína 9,5 (PGP 9.5) Mancha de forma fiable las fibras nerviosas y las células ganglionadas; La tinción PGP 9.5 actúa como un suplemento a la tinción de calretinin, especialmente en casos de hipoganglionosis aislada. La tinción doble con S100 y PGP 9.5 puede disminuir la tasa de falsos negativos y aumentar la sensibilidad. Como requisito previo, el estudio actual tiene como objetivo garantizar la especificidad adecuada y la alta sensibilidad de este novedoso método de diagnóstico. Nuestro nuevo protocolo usó los tres marcadores para la discriminación del intestino agangliónico y las fibras nerviosas hipertróficas. Un estudio prospectivo de 318 niños fue realizado por nuestro laboratorio y publicado previamente sin un protocolo detallado7. El protocolo detallado y las precauciones se discuten en este artículo. Los neonatos que sufrieron un grave problema de defecación desde el nacimiento o los niños con estreñimiento crónico, excluyendo otras enfermedades comunes, son candidatos potenciales para la biopsia de succión rectal (RSB). Nuestro nuevo protocolo es adecuado para la tinción no sólo de RSBs, sino también de biopsias de espesor completo o especímenes quirúrgicos para hacer un diagnóstico final.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí describimos un procedimiento que utiliza tres anticuerpos inmunohistoquímicos diferentes para teñir secciones de RBS para el diagnóstico de la EH. La sensibilidad de nuestro protocolo de diagnóstico fue del 96,49% (95% CI, 0,88-0.99), y la especificidad fue de 100% (95% IC, 0,97-1.00).
Los pasos más críticos del protocolo son la RSB y la reacción antígeno-anticuerpo. El tamaño de la biopsia determina la precisión de la coloración. Una pequeña biopsia no proporcionará suficie…
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a Weibing Tang por su gran ayuda en el suministro del laboratorio de filmación. Este artículo es apoyado por la investigación de bienestar público, y los fondos especiales fueron recibidos de la salud nacional y planificación familiar de China (Grant no. 201402007).
Materials
| calretinin antibody | MXB Biotechnologies | MAB-0716 170416405c | antibody: primary antibody |
| S-100 antibody | MXB Biotechnologies | Kit-0007 | antibody: primary antibody |
| PGP9.5 antibody | Shanghai long island antibody Co. Ltd | R-0457-03 | antibody: primary antibody |
| enhancer reagent | MXB Biotechnologies | KIT-9902-A 170416405a | antibody: secondary antibody A |
| Goat anti-Rabbit/Mouse IgG Secondary Antibody | MXB Biotechnologies | KIT-9902-B | antibody: secondary antibody B |
| DAB staining kit (containing reagent A B and C) | MXB Biotechnologies | DAB-0031 | staining kit |
| Heat incubator | Shanghai yiheng instrument Co. Ltd | DHP-9082 | instrument |
| Rbi2 suction rectal biopsy system | Aus Systems Pty Ltd, South Australia, Australia | CP1200 HP1000 SS1000 | instrument |
| microtome | Leica | leica RM2016 | instrument |
| citric acid sodium citrate buffer(100X) | MXB Biotechnologies | MVS-0101 | antigen retrieval buffer |
| pathological tissue dehydrator | wuhan junjie electronic Co. Ltd | JT-12F | instrument |
Referanslar
- Tam, P. K. Hirschsprung’s disease: A bridge for science and surgery. Journal of Pediatric Surgery. 51 (1), 18-22 (2016).
- Heanue, T. A., Pachnis, V. Enteric nervous system development and Hirschsprung’s disease: advances in genetic and stem cell studies. Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 466-479 (2007).
- Setiadi, J. A., Dwihantoro, A., Iskandar, K., Heriyanto, D. S., Gunadi, The utility of the hematoxylin and eosin staining in patients with suspected Hirschsprung disease. BMC Surgery. 17 (1), 71 (2017).
- Agrawal, R. K., et al. Acetylcholinesterase histochemistry (AChE) – A helpful technique in the diagnosis and in aiding the operative procedures of Hirschsprung disease. Diagnostic Pathology. 10 (1), 208 (2015).
- Kacar, A., Arikok, A. T., Azili, M. N., Ekberli Agirbas, G., Tiryaki, T. Calretinin immunohistochemistry in Hirschsprung’s disease: An adjunct to formalin-based diagnosis. The Turkish Journal of Gastroenterology. 23 (3), 226-233 (2012).
- Bachmann, L., et al. Immunohistochemical panel for the diagnosis of Hirschsprung's disease using antibodies to MAP2, calretinin, GLUT1 and S100. Histopathology. 66 (6), 824-835 (2015).
- Jiang, M., et al. S100 and protein gene product 9.5 immunostaining of rectal suction biopsies in the diagnosis of Hirschsprung’ disease. American Journal of Translational Research. 8 (7), 3159 (2016).
- Takawira, C., D’Agostini, S., Shenouda, S., Persad, R., Sergi, C. Laboratory procedures update on Hirschsprung disease. Journal of Pediatric Gastroenterology & Nutrition. 60 (5), 598 (2015).
- Meier-Ruge, W., et al. Acetylcholinesterase activity in suction biopsies of the rectum in the diagnosis of Hirschsprung’s disease. Journal of Pediatric Surgery. 7 (1), 11-17 (1972).
- Barshack, I., Fridman, E., Goldberg, I., Chowers, Y., Kopolovic, J. The loss of calretinin expression indicates aganglionosis in Hirschsprung’s disease. Journal of Clinical Pathology. 57 (7), 712-716 (2004).
- Kapur, R. P. Can We Stop Looking? Immunohistochemistry and the Diagnosis of Hirschsprung Disease. American Journal of Clinical Pathology. 126 (1), 9-12 (2006).
- Guinardsamuel, V., et al. Calretinin immunohistochemistry: a simple and efficient tool to diagnose Hirschsprung disease. Modern Pathology. 22 (10), 1379-1384 (2009).
- Robey, S. S., Kuhajda, F. P., Yardley, J. H. Immunoperoxidase stains of ganglion cells and abnormal mucosal nerve proliferations in Hirschsprung’s disease. Human Pathology. 19 (4), 432-437 (1988).
- Monforte-Muñoz, H., Gonzalez-Gomez, I., Rowland, J. M., Landing, B. H. Increased submucosal nerve trunk caliber in aganglionosis: a "positive" and objective finding in suction biopsies and segmental resections in Hirschsprung’s disease. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 122 (8), 721-725 (1998).
- Bachmann, L., et al. Immunohistochemical panel for the diagnosis of Hirschsprung's disease using antibodies to MAP2, calretinin, GLUT1 and S100. Histopathology. 66 (6), 824-835 (2015).
- Sams, V. R., Bobrow, L. G., Happerfield, L., Keeling, J. Evaluation of PGP9.5 in the diagnosis of Hirschsprung’s disease. Journal of Pathology. 168 (1), 55 (1992).
- Huang, Y., Anupama, B., Zheng, S., Xiao, X., Chen, L. The expression of enteric nerve markers and nerve innervation in total colonic aganglionosis. International Journal of Surgical Pathology. 19 (3), 303 (2011).
