Avaliação não-invasiva da função de músculos levantadores em ratos
Özet
Medição da função contrátil de músculo esquelético de roedores é uma ferramenta útil que pode ser usada para controlar a progressão da doença, bem como a eficácia da intervenção terapêutica. Descrevemos aqui a avaliação não-invasiva, na vivo dos músculos levantadores que podem ser repetidos ao longo do tempo no mouse mesmo.
Abstract
Avaliação da função contrátil de músculos esqueléticos é uma medida importante para tanto clínica e fins de pesquisa. Várias condições podem afetar negativamente o músculo esquelético. Isso pode resultar em uma perda de massa muscular (atrofia) e/ou perda de qualidade do músculo (reduzida força por unidade de músculo em massa), ambos os quais são predominantes na doença crônica, doença muscular específicos, imobilização e envelhecimento (sarcopenia). Função do músculo esquelético em animais pode ser avaliada por uma variedade de diferentes testes. Todos os testes têm limitações relacionadas com o ambiente de teste fisiológico, e a seleção de um teste específico, muitas vezes depende da natureza das experiências. Aqui, descrevemos uma técnica não-invasiva de in vivo, , envolvendo uma avaliação útil e fácil de força-curva de frequência (FFC) em ratos que podem ser executadas no mesmo animal ao longo do tempo. Isto permite o monitoramento da progressão da doença e/ou a eficácia de um tratamento terapêutico potencial.
Introduction
Músculo esquelético é um tecido metabólico importante que compreende cerca de 40% do peso total do corpo. Desempenha um papel crucial no controle da energia metabolismo e homeostase1. Músculo esqueletal massa é mantida por um delicado equilíbrio entre as taxas de1, de síntese e degradação da proteína. Numerosas condições de doença afetam esses processos no músculo esquelético, levando a uma perda líquida de massa muscular (atrofia). Estes incluem, mas não estão limitados a, envelhecimento de câncer, AIDS, jejum e de um membro imobilização2,3. O envelhecimento da população, perda de força é associada com uma perda de músculo de massa e é preditor de mortalidade de todos-caso4. Neste contexto, a avaliação da função muscular fornece uma medida importante ao determinar a eficácia de estratégias terapêuticas para combater e/ou evitar desperdiçar o músculo esquelético e perda de função.
Os investigadores utilizaram muitas abordagens diferentes e modelos animais para compreender as vias moleculares de músculo atrofia5,6 e as implicações desses mecanismos na função contrátil de músculo2,3 ,7. Portanto, correlacionar as alterações a nível molecular para as diferenças na função muscular é imperativo em entendimento como mudanças de nível moleculares podem afetar a funcionalidade do músculo.
Função do músculo esquelético, especialmente em pequenos roedores, geralmente é executada usando três procedimentos bem-descrito8,9 para detectar a deficiência de produção de força e/ou monitorar a progressão da doença. (1) ex vivo; onde músculo é removido do animal e incubado em solução de Ringer, um banho para avaliar a função muscular usando campo estimulação10. (2) In situ; onde a fixação proximal do músculo permanece no animal e o tendão distal está ligado a um transdutor de força, permitindo que a função do músculo deve ser executada por estimulação de nervo direto11. (3) In vivo; onde os eletrodos são colocados por via subcutânea para obter evocado-nervo músculo força produção9,12. Enquanto esses três procedimentos são usados para finalidades diferentes, cada um possuem vantagens e desvantagens. Portanto, é importante selecionar um método adequado, baseado no objectivo do estudo. A principal limitação com ex vivo experimentos é a remoção do músculo do seu ambiente normal e o uso da estimulação de campo. O método in situ mantém um suprimento de sangue normal e usa a estimulação através do nervo, mas é alterada a anatomia normal e a natureza do experimento é terminal; assim, isto faz medições de função muscular acompanhamento impossível. O método in vivo descrito aqui mais estreitamente imita normal fisiologia em que a anatomia é perturbada, o feixe neuromuscular permanece intacto, e o experimento não é terminal, permitindo que medidas de acompanhamento, dentro do mesmo animal ao longo do tempo8.
Aqui, descrevemos um procedimento in vivo que permite várias medições da função muscular no mesmo animal ao longo do tempo. Este procedimento envolve a avaliação dos músculos do compartimento anterior crural — incluindo o tibial anterior(TA), extensor longo dos dedos (EDL) e extensor hallicus músculos longus (EDH), responsáveis pela dorsiflexão — em um procedimento não-invasivo por estimulação de (também conhecido como fibular) nervo fibular. A TA fornece a maioria da força de dorsiflexão do tornozelo13, com apenas uma contribuição mínima pelo EDI e EDH que controlar o movimento dos dedos dos pés. Este protocolo não-terminal assegura a preservação do suprimento nervo e sangue. Isto permite a investigação da eficácia de evolução e tratamento de doenças ao longo do tempo no ambiente mais fisiológico atualmente disponível em um modelo animal.
Protocol
Representative Results
Discussion
Medição da função contrátil de muscular máximo de forma exata e reproduzível é fundamental para a avaliação progressiva da genética, metabólica e muscular condições17. Da mesma forma, função contrátil muscular in vivo permite a avaliação de novos tratamentos e terapêuticas para debilitante condições músculo. Aqui Demonstramos a medição da produção de força dos músculos levantadores do membro inferior posterior de rato através de um procedimento em que vivo.
Aparelhos comerciais são eficientes e úteis para executar este procedimento não-invasivo. Este teste fornece vantagens importantes relacionadas com a avaliação da função contrátil do músculo, preservando um ambiente fisiológico nativo, em que o sangue de abastecimento e inervação permanecem intactos. Por outro lado, suas desvantagens estão relacionadas à normalização da força por unidade de área seccional do músculo (força específica), que só pode ser verificada em um músculo isolado que é colhido após a experimentação da Cruz. No entanto, o teste não-invasivo permite várias medições da função contrátil dos músculos flexores no mesmo animal ao longo do tempo, resultando em número reduzido de animais experimentais, sendo necessários, especialmente se o objetivo é avaliar as alterações relativas ( alterações em vigor absoluto ao longo do tempo).
Há passos importantes que devem ser considerados durante este procedimento, a fim de obter dados consistentes sobre os momentos. Primeiro, um deve tentar padronizar o posicionamento animal, sempre que possível. Em segundo lugar, durante a criação é importante ser consistente com o posicionamento de eletrodo para que a estimulação ideal pode ser alcançada através da estimulação do nervo fibular. A localização dos eletrodos deve ser no lado lateral da perna (direita neste caso), perto da cabeça da fíbula e outros mais abaixo do lado lateral da perna (Figura 2). Com base nisso, os eletrodos feitos sob medidos são projetados como tal que ambos podem ser colocados na mesma posição sempre. No entanto, estimulação suficiente também pode ser conseguida usando as agulhas de eletrodo fornecidas com os aparelhos comerciais. Em terceiro lugar, é fundamental atingir picos negativos durante a configuração de tensão, girando no sentido horário o transdutor conectado para o estribo. Correto posicionamento dos eléctrodos de perna de rato com configuração máxima tensão tem demonstrado ser uma técnica que pode ser executada no mouse mesmo ao longo do tempo.
A capacidade de avaliar e controlar a função muscular em diferentes momentos do mesmo animal é uma importante avaliação para caracterizar doenças musculares diferentes, bem como a sua progressão. Além disso, esta medida de dorsiflexão muscular em ratos pode ser uma ferramenta para avaliar a eficácia de tratamentos potenciais em um ambiente fisiológico nativo, com o mínimo de estresse metabólico12. Assim, ele fornece uma técnica para avaliar o tratamento de doenças, sua progressão e potencial do músculo.
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Financiamento deste projeto foi da escola do exercício e Ciências da nutrição, Universidade de Deakin. Os autores gostaria de agradecer o Sr. Andrew Howarth pelo seu trabalho na otimização do dispositivo de eletrodos.
Materials
| 1300A: 3-in-1 Whole Animal System – Mouse | Aurora Scientific Inc. | 305C-LR: Dual-Mode Footplate; 605A: Dynamic Muscle Data Acquisition And Analysis System; 701C: Electrical Stimulator and 809C: in-situ Mouse Apparatus | Complete muscle function system |
| Conductive gel | Livingstone | ECGEL250 | conductive gel used in the mice |
| Eye ointment | Alcon | Poly Visc | pharmaceutic product (ophthalmic use) |
| nonsteroidal anti-inflammatory drug (NSAID) | Ilium | Metacam | veterinary medicine (injectable 5mg/ml) |
| Isoflurane | Zoetis | Isoflo | veterinary inhalation Anaesthetic |
Referanslar
- Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal muscle: a brief review of structure and function. Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).
- Gerlinger-Romero, F., Guimaraes-Ferreira, L., Yonamine, C. Y., Salgueiro, R. B., Nunes, M. T. Effects of beta-hydroxy-beta-methylbutyrate (HMB) on the expression of ubiquitin ligases, protein synthesis pathways and contractile function in extensor digitorum longus (EDL) of fed and fasting rats. The Journal of Physiological Sciences. 68 (2), 165-174 (2018).
- Pinheiro, C. H., et al. Metabolic and functional effects of beta-hydroxy-beta-methylbutyrate (HMB) supplementation in skeletal muscle. European Journal of Applied Physiology. 112 (7), 2531-2537 (2012).
- Metter, E. J., Talbot, L. A., Schrager, M., Conwit, R. Skeletal muscle strength as a predictor of all-cause mortality in healthy men. The Journal of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 57 (10), B359-B365 (2002).
- Foletta, V. C., White, L. J., Larsen, A. E., Leger, B., Russell, A. P. The role and regulation of MAFbx/atrogin-1 and MuRF1 in skeletal muscle atrophy. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 461 (3), 325-335 (2011).
- Zacharewicz, E., et al. Identification of microRNAs linked to regulators of muscle protein synthesis and regeneration in young and old skeletal muscle. PLoS One. 9 (12), e114009 (2014).
- Ryan, M. J., et al. Suppression of oxidative stress by resveratrol after isometric contractions in gastrocnemius muscles of aged mice. The Journal of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 65 (8), 815-831 (2010).
- Iyer, S. R., Valencia, A. P., Hernandez-Ochoa, E. O., Lovering, R. M. In Vivo Assessment of Muscle Contractility in Animal Studies. Methods in Molecular Biology. 1460, 293-307 (2016).
- Mintz, E. L., Passipieri, J. A., Lovell, D. Y., Christ, G. J. Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair. Journal of Visualized Experiments. (116), e54487 (2016).
- Hakim, C. H., Wasala, N. B., Duan, D. Evaluation of muscle function of the extensor digitorum longus muscle ex vivo and tibialis anterior muscle in situ in mice. Journal of Visualized Experiments. (72), e50183 (2013).
- Moorwood, C., Liu, M., Tian, Z., Barton, E. R. Isometric and eccentric force generation assessment of skeletal muscles isolated from murine models of muscular dystrophies. Journal of Visualized Experiments. 71, e50036 (2013).
- Lovering, R. M., Roche, J. A., Goodall, M. H., Clark, B. B., McMillan, A. An in vivo rodent model of contraction-induced injury and non-invasive monitoring of recovery. Journal of Visualized Experiments. (51), e50036 (2011).
- Corona, B. T., Ward, C. L., Baker, H. B., Walters, T. J., Christ, G. J. Implantation of in vitro tissue engineered muscle repair constructs and bladder acellular matrices partially restore in vivo skeletal muscle function in a rat model of volumetric muscle loss injury. Tissue Engineering Part A. 20 (3-4), 705-715 (2014).
- Collins, B. C., et al. Deletion of estrogen receptor alpha in skeletal muscle results in impaired contractility in female mice. Journal of Applied Physiology (1985). 124 (4), 980-992 (2018).
- Lynch, G. S., Hinkle, R. T., Chamberlain, J. S., Brooks, S. V., Faulkner, J. A. Force and power output of fast and slow skeletal muscles from mdx mice 6-28 months old. The Journal of Physiology. 535 (Pt 2), 591-600 (2001).
- Vitzel, K. F., et al. In Vivo Electrical Stimulation for the Assessment of Skeletal Muscle Contractile Function in Murine Models. Methods in Molecular Biology. 1735, 381-395 (2018).
- Jackman, R. W., Kandarian, S. C. The molecular basis of skeletal muscle atrophy. American Journal of Physiology Cell Physiology. 287 (4), C834-C843 (2004).
