マウスで内がえし筋機能の非侵襲的評価

すべての実験手順は、ディーキン大学動物倫理委員会 (プロジェクト #G19/2014) によって承認されました。 1. 機器のセットアップ すべてのマシンが正しく接続されていることを確認します。 コンピューター、高出力の 2 相刺激とデュアル モード レバー システムを入れます。 プラットフォーム上マウス膝クランプとして、組み立てのマウス フット プレートを設定します。 37 ° C に加熱プラットフォームを有効に デスクトップ上の動的筋制御ソフトウェアを開きます。注:これは、機能のテストを実行するために必要なソフトウェアです。 2. ソフトウェアおよびモデルのセットアップ プログラムが開かれる (図 1)、探触子を校正し、セットアップを選択 |私の楽器 |調整。 「セットアップ」ボタンをInstantStimを選択して、”実行時”パラメーター 120 に変更 s (図 1 a)。注:最適な電圧は、単一のけいれんを実行する、手動での設定、または必要な回数だけ、InstantStim を開始によっても実現できます。 自動車の名前を入力する「自動保存ベース」というラベルの付いたタイプができるウィンドウでファイルの場所 (例:, mouse1-日付-timepoint1) を保存します。「自動保存ベース」ウィンドウの左側にあるチェック ボックスをクリックしてし、自動保存を有効にするに変更。 DMC コントロールの上部には、画面はシーケンサー、新しいポップアップ ウィンドウを開くに移動します。シーケンスを開くを選択し、選択する既成のプロトコル (図 1 b) を使用します。ロード シーケンスをクリックして |ウィンドウを閉じる。注:この手順を使用して力周波数曲線 (FFC) テストを生成 (1、10、20、30、40、50、60、80、100、150、200、250 Hz)。 10 に「範囲」ノブを設定 2 相刺激の mA。注:「調整」ノブ (隣の右下) はゼロのことを確認します。この微調整により、電極のセットアップです。 3. マウスのセットアップ 注:すべての力の測定は 12 週齢で雄の野生型マウス (C57BI/6) に行った。 5% イソフルラン (ノーズ吸入) 経由で 1 L/分の酸素流量で麻酔室に各マウスを置きます、マウスが意識を失うまで。足反射の消失によって適切な麻酔を確認します。 電動バリカンでシェービングによるマウスの右脚のすべての髪を削除します。 温水のプラットフォームで仰臥位に動物を置き、きれいに右足 70% アルコールとヨウ素 (いずれかの側を使用することができます)。この時点で、2% (1 L/分で酸素の流れ) のイソフルランを調整し、電極が配置される場所の皮膚に導電性ゲルを適用します。注:直腸温度プローブを使用して、プロシージャの間に体の温度を監視し、目を乾燥や損傷を防ぐために眼軟膏を適用します。 板の間の上に足を置き、医療用テープを使用して添付します。安定プロシージャの間に脚を固定し膝をクランプします。注:安定化を提供するために近位脛骨 (仮筋の後方)12を介して挿入された非常に薄いピンを使用していくつかの研究を説明しました。このプロトコルは、不必要な圧縮/膝を損傷することがなく十分な安定化を提供するよう、クランプ、付き合えない。クランプは、まだ筋肉収縮性の正確な評価を可能にしながら、トランス骨ピンを作成可能性があります潜在的な炎症を回避できます。さらに、マウス膝クランプは正常に使用される14をされています。 この時点で足首 (図 2) に 90 ° の角度があるので、マウスの後肢の位置のプラットフォームでノブを使用します。 4 電極位置の最適化 マウスのプラットフォーム上に配置すると、一度 (皮下) 右足の皮膚の下に電極を配置します。注:これは重要なステップと 4.4 の手順でセットアップ中に目的の位置を取得する必要がありますいくつかの再配置。 右脚の外側に電極を配置します。(図 2) の脚の側面のより遠位腓骨とその他の電極の頭部近くに 1 つを配置します。注:特注電極システムは、この手順を最適化するために設計されています。ただし、このシステムでは、製造元から提供された電極針でこのテストを実行することができます。 これらの手順は、一度は、ハイパワーの 2 相刺激の結果最大背屈トルク、腓骨神経の刺激を取得する必要に応じて、「調整」というラベルの付いたつまみを調整します。注:この範囲は、大人の野生型マウス未満 2 mA;ただし、これは、サイズ、年齢、および動物の性別に依存しているかもしれません。力生産 (曲線のピーク) は、最大の力に到達するまでゆっくりと増加する必要があります。 刺激の中には、探触子を腓骨神経によって電極刺激を内がえし筋のみを確認することが重要である (図 3)、負の値を生成するため回り。一度このステップを達成すると、プロシージャの間に任意の動きを防止するクランプを使用して電極を安定させます。注:ピークが現れる、大きくゆっくりと最大アンペア数が 3 つ以上の連続した刺激が同一の収縮性のある結果をレベルとして決定されます。必要に応じてより高いアンペア数を回す抵抗します。最大アンペア数が近隣と刺激潜在的拮抗筋が収縮、正の値のピークを生成することができます共同収縮を引き起こしています。 ソフトウェアのインスタント スティミュラスを停止します。 メイン画面 (ステップ 2.4 で説明されている) 以前のセットアップ シーケンスを開始する「シーケンスの開始」ボタンを押してオンにします。 5. 手順を終了 力の測定が完了すると、電極を削除、膝クランプを外し、足テープを取り外します。 イソフルランを切り、動物の回復を助ける、数分間酸素供給を維持します。マウス移動を開始および/または意識を取り戻すし、自己の権利が、そのケージに戻します。注:非ステロイド性抗炎症薬 (NSAID) を皮下に注射することができます (1 mg/kg メロキシカム) プロシージャの後の不快感や痛みを防ぐために。 6. データの分析 データ分析ソフトウェアを開きます。 高スループット(画面左) に移動します。上記分析に選択力周波数は、セットアップ シーケンスを説明します。 マニュアルを選択し、「エンド カーソル」の値を 3 に変更します。また削除の基準を選択します。 以前に実行されたプロシージャにアクセスし、[分析] をクリックしてファイルの選択をクリックします。この時点で、結果を画面上でアクセスまたはさらに分析や計算のスプレッドシートにエクスポートできます。注:データ測定した mN;しかし、トルクは (絶対的な力) のレバー腕の長さで力の値を乗算することによって計算できます。正規化が必要 (特定力) の場合は、体重、トルクを正規化することができます。 またはターミナル実験は同年齢の筋肉量を収集するために実行できます。