Polmone microRNA Profiling attraverso il ciclo estrale in topi esposti a ozono
Özet
Qui descriviamo un metodo per valutare l’espressione di polmone di Mirna che sono preveduti per regolare i geni infiammatori utilizzando topi esposti all’ozono o aria filtrata nelle diverse fasi del ciclo estrale.
Abstract
Profilatura di MicroRNA (miRNA) è diventato di interesse per i ricercatori che lavorano in diverse aree di ricerca della biologia e della medicina. Gli studi correnti indicano un promettente futuro di utilizzando miRNA nella diagnosi e cura di malattie polmonari. Qui, viene definito un protocollo per i miRNA profilatura per misurare l’abbondanza relativa di un gruppo di Mirna preveduti che regolano i geni infiammatori nel tessuto polmonare da di un modello di topo di infiammazione delle vie aeree indotta da ozono. Perché è stato dimostrato che livelli di ormoni sessuali circolanti possono influire sulla regolazione dell’immunità innata del polmone nelle femmine, lo scopo di questo metodo è di descrivere un miRNA infiammatoria profilatura protocollo nei topi femmina, prendendo in considerazione il ciclo estrale fase di ogni animale al momento dell’esposizione all’ozono. Ci rivolgiamo anche approcci di bioinformatica applicabile a miRNA discovery e destinazione metodi di identificazione tramite limma, un software R/Bioconductor, e software di analisi funzionale per capire il contesto biologico e percorsi associati con espressione differenziale dei miRNA.
Introduction
i microRNA (Mirna) sono brevi (19-25 nucleotidi), naturale, non-codificanti molecole di RNA. Sequenze di Mirna sono evolutivi conservata tra le specie, suggerendo l’importanza di miRNA nel regolare le funzioni fisiologiche1. Profilo di espressione di microRNA ha dimostrato di essere utile per l’identificazione di Mirna che sono importanti nella regolazione di vari processi, tra cui la risposta immunitaria, differenziamento cellulare, processi di sviluppo e apoptosi2. Più recentemente, Mirna sono stati riconosciuti per il loro uso potenziale nella malattia diagnostica e terapeutica. Per i ricercatori che studiano i meccanismi di regolazione genica, espressione dei miRNA di misurazione può illuminare sistemi-livello modelli di processi normativi, soprattutto quando le informazioni di miRNA sono unite con profilatura di mRNA e altri dati su scala genomica3. D’altra parte, i miRNA hanno anche dimostrati di essere più stabili di mRNA in una gamma di tipi di campioni e sono anche misurabili con sensibilità maggiore di proteine4. Questo ha portato alla notevole interesse nello sviluppo di Mirna come biomarcatori per diverse applicazioni di diagnostiche molecolare, tra cui malattie polmonari.
Nel polmone, miRNA svolgono un ruolo importante nei processi di sviluppo e il mantenimento dell’omeostasi. Inoltre, la loro espressione anormale è stato associato con lo sviluppo e la progressione di varie malattie polmonari5. Malattia infiammatoria polmonare indotta dall’inquinamento atmosferico ha dimostrato una maggiore gravità e prognosi nelle femmine, che indica che gli ormoni e il ciclo estrale può regolare del polmone innata immunità e miRNA espressione in risposta alle sfide ambientali 6. nel presente protocollo, usiamo l’esposizione dell’ozono, che è una componente importante di inquinamento atmosferico, per indurre una forma di infiammazione polmonare in topi femminili che si verifica in assenza di immunità adattativa. Utilizzando ozono, noi stiamo inducendo lo sviluppo di hyperresponsiveness della via aerea che è associato con danno delle cellule epiteliali delle vie aeree e un aumento in neutrofili e mediatori infiammatori nelle vie aeree prossimali7. Attualmente, non esistono protocolli ben descritti a caratterizzare e analizzare Mirna attraverso il ciclo estrale in topi esposti a ozono.
Di seguito, descriviamo un metodo semplice per identificare le fasi del ciclo estrale ed espressione dei miRNA nel tessuto polmonare dei topi femminili esposti all’ozono. Ci rivolgiamo anche bioinformatica efficaci approcci all’identificazione di scoperta e di destinazione di miRNA, con un’enfasi su biologia computazionale. Analizziamo i dati di microarray utilizzando limma, un software R/Bioconductor che fornisce una soluzione integrata per l’analisi dei dati di espressione genica esperimenti8. Analisi dei dati di matrice PCR da limma ha un vantaggio in termini di potenza sul t-test basato procedure quando si utilizza il piccolo numero di matrici/campioni per confrontare l’espressione. Per comprendere il contesto biologico di risultati di espressione di miRNA, abbiamo poi utilizzato il software di analisi funzionale. Al fine di comprendere i meccanismi di regolazione trascrizionale modifiche e a prevedere i risultati probabili, il software combina i set di dati di espressione dei miRNA e conoscenza dalla letteratura9. Questo è un vantaggio se confrontato con software che basta guardare per statistica arricchimento in sovrapposizione a insiemi di Mirna.
Protocol
Representative Results
Discussion
MicroRNA profiling è una tecnica vantaggiosa sia per la diagnosi delle malattie e ricerca meccanicistico. In questo manoscritto, abbiamo definito un protocollo per la valutazione dell’espressione dei miRNA che sono preveduti per regolare i geni infiammatori nei polmoni dei topi femminili esposti all’ozono nelle fasi differenti ciclo estrale. Metodi per la determinazione del ciclo estrale, ad esempio il metodo di rilevamento visivo, sono stati descritti16. Tuttavia, questi si basano su misure una …
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni dal NIH K01HL133520 (PS) e K12HD055882 (PS). Gli autori ringraziano il Dr. Joanna Floros per l’assistenza con gli esperimenti di esposizione di ozono.
Materials
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | 000664 | 8 weeks old |
| UltraPure Water | Thermo Fisher Scientific | 10813012 | |
| Sterile plastic pipette | Fisher Scientific | 13-711-25 | Capacity: 1.7mL |
| Frosted Microscope Slides | Thermo Fisher Scientific | 2951TS | |
| Light microscope | Microscope World | MW3-H5 | 10X and 20X objective |
| Ketathesia- Ketamine HCl Injection USP | Henry Schein Animal Health | 55853 | 90 mg/kg. Controlled drug. |
| Xylazine Sterile Solution | Lloyd Laboratories | 139-236 | 10mg/kg. Controlled Drug. |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818100 | Dilute to 70% ethanol with water. |
| 21G gauge needle | BD Biosciences | 305165 | |
| Syringe | Fisher Scientific | 329654 | 1mL |
| Operating Scissors | World Precision Instruments | 501221, 504613 | 14cm, Sharp/Blunt, Curved and 9 cm, Straight, Fine Sharp Tip |
| Tweezer Kit | World Precision Instruments | 504616 | |
| -80 ˚C freezer | Forma | 7240 | |
| Spectrum Bessman Tissue Pulverizers | Fisher Scientific | 08-418-1 | Capacity: 10 to 50mg |
| RNase-free Microfuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | AM12400 | 1.5 mL |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
| Direct-zol RNA MiniPrep Plus | Zymo Research | R2071 | |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | |
| miScript II RT kit | Qiagen | 218161 | |
| Mouse Inflammatory Response & Autoimmunity miRNA PCR Array | Qiagen | MIMM-105Z | |
| Thin-walled, DNase-free, RNase-free PCR tubes | Thermo Fisher Scientific | AM12225 | for 20 μl reactions |
| miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control | Qiagen | 219610 | |
| Microsoft Excel | Microsoft Corporation | https://office.microsoft.com/excel/ | |
| Ingenuity Pathway Analysis | Qiagen | https://www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuity-pathway-analysis/ | |
| R Software | The R Foundation | https://www.r-project.org/ | |
| Thermal cycler or chilling/heating block | General Lab Supplier | ||
| Microcentrifuge | General Lab Supplier | ||
| Real-time PCR cycler | General Lab Supplier | ||
| Multichannel pipettor | General Lab Supplier | ||
| RNA wash buffer | Zymo Research | R1003-3-48 | 48 mL |
| DNA digestion buffer | Zymo Research | E1010-1-4 | 4 mL |
| RNA pre-wash buffer | Zymo Research | R1020-2-25 | 25 mL |
| Ultraviolet ozone analyzer | Teledyne API | Model T400 | http://www.teledyne-api.com/products/oxygen-compound-instruments/t400 |
| Mass flow controllers | Sierra Instruments Inc | Flobox 951/954 | http://www.sierrainstruments.com/products/954p.html |
Referanslar
- Rebane, A., Akdis, C. A. MicroRNAs: Essential players in the regulation of inflammation. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (1), 15-26 (2013).
- Cannell, I. G., Kong, Y. W., Bushell, M. How do microRNAs regulate gene expression?. Biochemical Society Transactions. 36 (Pt 6), 1224-1231 (2008).
- Pritchard, C. C., Cheng, H. H., Tewari, M. MicroRNA profiling: approaches and considerations. Nature Reviews Genetics. 13 (5), 358-369 (2012).
- Mi, S., Zhang, J., Zhang, W., Huang, R. S. Circulating microRNAs as biomarkers for inflammatory diseases. Microrna. 2 (1), 63-71 (2013).
- Sessa, R., Hata, A. Role of microRNAs in lung development and pulmonary diseases. Pulmonary Circulation. 3 (2), 315-328 (2013).
- Fuentes, N., Roy, A., Mishra, V., Cabello, N., Silveyra, P. Sex-specific microRNA expression networks in an acute mouse model of ozone-induced lung inflammation. Biology of Sex Differences. 9 (1), 18 (2018).
- Aris, R. M., et al. Ozone-induced airway inflammation in human subjects as determined by airway lavage and biopsy. American Review of Respiratory Disease. 148 (5), 1363-1372 (1993).
- Ritchie, M. E., et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Research. 43 (7), e47 (2015).
- Krämer, A., Green, J., Pollard, J., Tugendreich, S. Causal analysis approaches in Ingenuity Pathway Analysis. Biyoinformatik. 30 (4), 523-530 (2014).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).
- Umstead, T. M., Phelps, D. S., Wang, G., Floros, J., Tarkington, B. K. In vitro exposure of proteins to ozone. Toxicology Mechanisms and Methods. 12 (1), 1-16 (2002).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Phipson, B., Lee, S., Majewski, I. J., Alexander, W. S., Smyth, G. K. Robust hyperparameter estimation protects against hypervariable genes and improves power to detect differential expression. Annals of Applied Statistics. 10 (2), 946-963 (2016).
- Smyth, G. K., et al. Linear Models for Microarray and RNA-Seq Data User’s Guide. Bioconductor. , (2002).
- Benjamini, Y., Hochberg, Y. Controlling the False Discovery Rate: A Practical and Powerful Approach to Multiple Testing. Journal of the Royal Statistical Society. Series B (Methodological). 57 (1), 289-300 (1995).
- Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. Public Library of Science ONE. 7 (4), e35538 (2012).
- Alves, M. G., et al. Comparison of RNA Extraction Methods for Molecular Analysis of Oral Cytology. Acta Stomatologica Croatica. 50 (2), 108-115 (2016).
- Wilfinger, W. W., Mackey, K., Chomczynski, P. Effect of pH and ionic strength on the spectrophotometric assessment of nucleic acid purity. Biotechniques. 22 (3), 478-481 (1997).
- Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).
- Walker, S. E., Lorsch, J. RNA purification- precipitation methods. Methods in Enzymology. 530, 337-343 (2013).
- Git, A., et al. Systematic comparison of microarray profiling, real-time PCR, and next-generation sequencing technologies for measuring differential microRNA expression. RNA. 16 (5), 991-1006 (2010).
- Smyth, G. K. Limma: linear models for microarray data. Bioinformatics and Computational Biology Solutions Using R and Bioconductor. , 397-420 (2005).
- Griffiths-Jones, S. miRBase: the microRNA sequence database. Methods Mol Biol. 342, 129-138 (2006).
- Sethupathy, P., Corda, B., Hatzigeorgiou, A. TarBase: A comprehensive database of experimentally supported animal microRNA targets. RNA. 12 (2), 192-197 (2006).
- Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J., Bartel, D. P. Predicting effective microRNA target sites in mammalian mRNAs. eLife. 4, e05005 (2015).
- Xiao, F., Zuo, Z., Cai, G., Kang, S., Gao, X., Li, T. miRecords: an integrated resource for microRNA-target interactions. Nucleic Acids Res. 37, D105-D110 (2009).
- Mullany, L. E., Wolff, R. K., Slattery, M. L. Effectiveness and Usability of Bioinformatics Tools to Analyze Pathways Associated with miRNA Expression. Cancer Informatics. 14, 121-130 (2015).
