MicroARN pulmón perfilado a través de la el ciclo estral en ratones expuestos al ozono
Özet
Aquí se describe un método para evaluar la expresión pulmonar de miRNAs que se predicen para regular genes inflamatorios utilizando ratones expuestos al ozono o aire filtrado en las diferentes etapas del ciclo estral.
Abstract
Perfiles de microARN (miARN) ha sido de interés para los investigadores que trabajan en diversas áreas de investigación de biología y medicina. Los estudios actuales muestran un promisorio futuro de miRNAs en el diagnóstico y cuidado de enfermedades pulmonares. Aquí, se define un protocolo para miRNA perfilado para medir la abundancia relativa de un grupo de miRNAs predicho para regular genes inflamatorios en el tejido pulmonar de un modelo de ratón de inflamación de las vías respiratorias inducida por ozono. Ya se ha demostrado que los niveles de hormonas sexuales circulantes pueden afectar la regulación de la inmunidad innata del pulmón en las mujeres, el propósito de este método es describir un inflamatorio miRNA perfiles de protocolo en los ratones hembra, teniendo en cuenta el ciclo estral etapa de cada animal en el momento de exposición al ozono. Nos dirigimos también a enfoques de la bioinformática aplicable a miRNA descubrimiento y objetivo de los métodos de identificación usando limma, un software de R/Bioconductor, y software de análisis funcional para comprender el contexto biológico y vías asociadas con expresión diferencial de miRNA.
Introduction
microRNAs (miRNAs) son cortos (19 a 25 nucleótidos), que ocurre naturalmente, no-codificación moléculas de ARN. Secuencias de miRNAs son evolutivas conservada entre especies, lo que sugiere la importancia de los miRNAs en la regulación de funciones fisiológicas1. perfiles de expresión de microRNA ha demostrado para ser útil para la identificación de miRNAs que son importantes en la regulación de una variedad de procesos, incluyendo la respuesta inmune, diferenciación celular, desarrollo y apoptosis2. Más recientemente, miRNAs han sido reconocidos por su uso potencial en el diagnóstico de la enfermedad y terapéutica. Para los investigadores estudiando mecanismos de regulación génica, medición de expresión de miRNA puede iluminar modelos de nivel de sistemas de procesos regulatorios, especialmente cuando miRNA información se combina con perfiles de mRNA y otros datos de genoma-escala3. Por otro lado, los miRNAs también han demostrado ser más estable que los mRNAs en una gama de tipos de muestra y también son mensurables con mayor sensibilidad a las proteínas4. Esto ha llevado a un interés considerable en el desarrollo de miRNAs como biomarcadores para diversas aplicaciones diagnóstico moleculares, incluyendo enfermedades pulmonares.
En el pulmón, los miRNAs desempeñan papeles importantes en procesos de desarrollo y el mantenimiento de la homeostasis. Por otra parte, su expresión anormal se ha asociado con el desarrollo y progresión de varias enfermedades pulmonares5. Neumopatía inflamatoria inducida por contaminación del aire ha demostrado mayor severidad y peor pronóstico en las mujeres, lo que indica que las hormonas y el ciclo estral pueden regular pulmón innata inmunidad y miRNA expresión en respuesta a retos ambientales 6. en el presente Protocolo, utilizamos la exposición al ozono, que es un componente importante de la contaminación atmosférica, para inducir una forma de inflamación del pulmón en ratones hembra que se produce en ausencia de inmunidad adaptativa. Mediante el uso de ozono, estamos induciendo el desarrollo de hipersensibilidad de las vías respiratorias que se asocia con daño a las células epiteliales de las vías respiratorias y un aumento de neutrófilos y mediadores inflamatorios en las vías respiratorias proximales7. Actualmente, no existen protocolos bien-descritos para caracterizar y analizar miRNAs en el ciclo estral en ratones expuestos al ozono.
A continuación, describimos un método simple para identificar las etapas del ciclo estral y la expresión de miRNA en el tejido de pulmón de ratones femeninos expuestos a ozono. También abordamos enfoques eficaces bioinformática a miRNA de descubrimiento y objetivo de identificación, con énfasis en biología computacional. Analizamos los datos de microarray utilizando limma, un software de R/Bioconductor que proporciona una solución integrada para el análisis de datos del gene expresión experimentos8. Análisis de datos de matriz PCR de limma tiene una ventaja en términos de poder sobre procedimientos de prueba t de base cuando se utiliza un número pequeño de muestras de matrices para comparar la expresión. Para comprender el contexto biológico de los resultados de expresión de miRNA, entonces utilizamos el software de análisis funcional. Para entender los mecanismos de regulación transcripcionales cambios y predecir resultados probables, el software combina conjuntos de datos de expresión de miRNA y el conocimiento de la literatura9. Esto es una ventaja en comparación con el software que sólo buscan enriquecimiento estadístico en superposición a conjuntos de miRNAs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Perfiles de microARN es una técnica ventajosa para investigación mecanicista y diagnosis de la enfermedad. En este manuscrito, se definió un protocolo para evaluar la expresión de miRNAs que se predicen para regular genes inflamatorios en los pulmones de ratones femeninos expuestos a ozono en etapas del ciclo estral diferentes. Métodos para la determinación del ciclo estral, como el método de detección visual, han sido descrito16. Sin embargo, estos dependen de las mediciones de una sola v…
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue apoyada por subvenciones de NIH K01HL133520 (PS) y K12HD055882 (PS). Los autores agradecen a Dr. Joanna Floros para la ayuda con experimentos de exposición de ozono.
Materials
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | 000664 | 8 weeks old |
| UltraPure Water | Thermo Fisher Scientific | 10813012 | |
| Sterile plastic pipette | Fisher Scientific | 13-711-25 | Capacity: 1.7mL |
| Frosted Microscope Slides | Thermo Fisher Scientific | 2951TS | |
| Light microscope | Microscope World | MW3-H5 | 10X and 20X objective |
| Ketathesia- Ketamine HCl Injection USP | Henry Schein Animal Health | 55853 | 90 mg/kg. Controlled drug. |
| Xylazine Sterile Solution | Lloyd Laboratories | 139-236 | 10mg/kg. Controlled Drug. |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818100 | Dilute to 70% ethanol with water. |
| 21G gauge needle | BD Biosciences | 305165 | |
| Syringe | Fisher Scientific | 329654 | 1mL |
| Operating Scissors | World Precision Instruments | 501221, 504613 | 14cm, Sharp/Blunt, Curved and 9 cm, Straight, Fine Sharp Tip |
| Tweezer Kit | World Precision Instruments | 504616 | |
| -80 ˚C freezer | Forma | 7240 | |
| Spectrum Bessman Tissue Pulverizers | Fisher Scientific | 08-418-1 | Capacity: 10 to 50mg |
| RNase-free Microfuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | AM12400 | 1.5 mL |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
| Direct-zol RNA MiniPrep Plus | Zymo Research | R2071 | |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | |
| miScript II RT kit | Qiagen | 218161 | |
| Mouse Inflammatory Response & Autoimmunity miRNA PCR Array | Qiagen | MIMM-105Z | |
| Thin-walled, DNase-free, RNase-free PCR tubes | Thermo Fisher Scientific | AM12225 | for 20 μl reactions |
| miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control | Qiagen | 219610 | |
| Microsoft Excel | Microsoft Corporation | https://office.microsoft.com/excel/ | |
| Ingenuity Pathway Analysis | Qiagen | https://www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuity-pathway-analysis/ | |
| R Software | The R Foundation | https://www.r-project.org/ | |
| Thermal cycler or chilling/heating block | General Lab Supplier | ||
| Microcentrifuge | General Lab Supplier | ||
| Real-time PCR cycler | General Lab Supplier | ||
| Multichannel pipettor | General Lab Supplier | ||
| RNA wash buffer | Zymo Research | R1003-3-48 | 48 mL |
| DNA digestion buffer | Zymo Research | E1010-1-4 | 4 mL |
| RNA pre-wash buffer | Zymo Research | R1020-2-25 | 25 mL |
| Ultraviolet ozone analyzer | Teledyne API | Model T400 | http://www.teledyne-api.com/products/oxygen-compound-instruments/t400 |
| Mass flow controllers | Sierra Instruments Inc | Flobox 951/954 | http://www.sierrainstruments.com/products/954p.html |
Referanslar
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