Özet

Polmone microRNA Profiling attraverso il ciclo estrale in topi esposti a ozono

Published: January 07, 2019
doi:

Özet

Qui descriviamo un metodo per valutare l’espressione di polmone di Mirna che sono preveduti per regolare i geni infiammatori utilizzando topi esposti all’ozono o aria filtrata nelle diverse fasi del ciclo estrale.

Abstract

Profilatura di MicroRNA (miRNA) è diventato di interesse per i ricercatori che lavorano in diverse aree di ricerca della biologia e della medicina. Gli studi correnti indicano un promettente futuro di utilizzando miRNA nella diagnosi e cura di malattie polmonari. Qui, viene definito un protocollo per i miRNA profilatura per misurare l’abbondanza relativa di un gruppo di Mirna preveduti che regolano i geni infiammatori nel tessuto polmonare da di un modello di topo di infiammazione delle vie aeree indotta da ozono. Perché è stato dimostrato che livelli di ormoni sessuali circolanti possono influire sulla regolazione dell’immunità innata del polmone nelle femmine, lo scopo di questo metodo è di descrivere un miRNA infiammatoria profilatura protocollo nei topi femmina, prendendo in considerazione il ciclo estrale fase di ogni animale al momento dell’esposizione all’ozono. Ci rivolgiamo anche approcci di bioinformatica applicabile a miRNA discovery e destinazione metodi di identificazione tramite limma, un software R/Bioconductor, e software di analisi funzionale per capire il contesto biologico e percorsi associati con espressione differenziale dei miRNA.

Introduction

i microRNA (Mirna) sono brevi (19-25 nucleotidi), naturale, non-codificanti molecole di RNA. Sequenze di Mirna sono evolutivi conservata tra le specie, suggerendo l’importanza di miRNA nel regolare le funzioni fisiologiche1. Profilo di espressione di microRNA ha dimostrato di essere utile per l’identificazione di Mirna che sono importanti nella regolazione di vari processi, tra cui la risposta immunitaria, differenziamento cellulare, processi di sviluppo e apoptosi2. Più recentemente, Mirna sono stati riconosciuti per il loro uso potenziale nella malattia diagnostica e terapeutica. Per i ricercatori che studiano i meccanismi di regolazione genica, espressione dei miRNA di misurazione può illuminare sistemi-livello modelli di processi normativi, soprattutto quando le informazioni di miRNA sono unite con profilatura di mRNA e altri dati su scala genomica3. D’altra parte, i miRNA hanno anche dimostrati di essere più stabili di mRNA in una gamma di tipi di campioni e sono anche misurabili con sensibilità maggiore di proteine4. Questo ha portato alla notevole interesse nello sviluppo di Mirna come biomarcatori per diverse applicazioni di diagnostiche molecolare, tra cui malattie polmonari.

Nel polmone, miRNA svolgono un ruolo importante nei processi di sviluppo e il mantenimento dell’omeostasi. Inoltre, la loro espressione anormale è stato associato con lo sviluppo e la progressione di varie malattie polmonari5. Malattia infiammatoria polmonare indotta dall’inquinamento atmosferico ha dimostrato una maggiore gravità e prognosi nelle femmine, che indica che gli ormoni e il ciclo estrale può regolare del polmone innata immunità e miRNA espressione in risposta alle sfide ambientali 6. nel presente protocollo, usiamo l’esposizione dell’ozono, che è una componente importante di inquinamento atmosferico, per indurre una forma di infiammazione polmonare in topi femminili che si verifica in assenza di immunità adattativa. Utilizzando ozono, noi stiamo inducendo lo sviluppo di hyperresponsiveness della via aerea che è associato con danno delle cellule epiteliali delle vie aeree e un aumento in neutrofili e mediatori infiammatori nelle vie aeree prossimali7. Attualmente, non esistono protocolli ben descritti a caratterizzare e analizzare Mirna attraverso il ciclo estrale in topi esposti a ozono.

Di seguito, descriviamo un metodo semplice per identificare le fasi del ciclo estrale ed espressione dei miRNA nel tessuto polmonare dei topi femminili esposti all’ozono. Ci rivolgiamo anche bioinformatica efficaci approcci all’identificazione di scoperta e di destinazione di miRNA, con un’enfasi su biologia computazionale. Analizziamo i dati di microarray utilizzando limma, un software R/Bioconductor che fornisce una soluzione integrata per l’analisi dei dati di espressione genica esperimenti8. Analisi dei dati di matrice PCR da limma ha un vantaggio in termini di potenza sul t-test basato procedure quando si utilizza il piccolo numero di matrici/campioni per confrontare l’espressione. Per comprendere il contesto biologico di risultati di espressione di miRNA, abbiamo poi utilizzato il software di analisi funzionale. Al fine di comprendere i meccanismi di regolazione trascrizionale modifiche e a prevedere i risultati probabili, il software combina i set di dati di espressione dei miRNA e conoscenza dalla letteratura9. Questo è un vantaggio se confrontato con software che basta guardare per statistica arricchimento in sovrapposizione a insiemi di Mirna.

Protocol

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) della Penn State University. 1. valutazione della fase del ciclo estrale Frenare correttamente una femmina mouse C57BL/6 (8 – 9 settimane) utilizzando la tecnica di ritenuta del mouse con una sola mano descritta in Machholz et al.10. Riempire la pipetta di plastica sterile con 10 μL di acqua ultra-pura. Introdurre la punta della pipett…

Representative Results

I tipi differenti delle cellule osservati negli strisci vengono utilizzati per identificare la fase del ciclo estrale del mouse (Figura 1). Questi sono identificati dalla morfologia delle cellule. Durante il proestro, le cellule sono quasi esclusivamente gruppi di cellule epiteliali nucleate forma circolare, ben formate (Figura 1A). Quando il mouse è in fase di estro, le cellule sono cellule epiteliali squamous cornified, presen…

Discussion

MicroRNA profiling è una tecnica vantaggiosa sia per la diagnosi delle malattie e ricerca meccanicistico. In questo manoscritto, abbiamo definito un protocollo per la valutazione dell’espressione dei miRNA che sono preveduti per regolare i geni infiammatori nei polmoni dei topi femminili esposti all’ozono nelle fasi differenti ciclo estrale. Metodi per la determinazione del ciclo estrale, ad esempio il metodo di rilevamento visivo, sono stati descritti16. Tuttavia, questi si basano su misure una …

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni dal NIH K01HL133520 (PS) e K12HD055882 (PS). Gli autori ringraziano il Dr. Joanna Floros per l’assistenza con gli esperimenti di esposizione di ozono.

Materials

C57BL/6J mice The Jackson Laboratory 000664 8 weeks old
UltraPure Water Thermo Fisher Scientific 10813012
Sterile plastic pipette Fisher Scientific 13-711-25 Capacity: 1.7mL
Frosted Microscope Slides Thermo Fisher Scientific 2951TS
Light microscope Microscope World MW3-H5 10X and 20X objective
Ketathesia- Ketamine HCl Injection USP Henry Schein Animal Health 55853 90 mg/kg. Controlled drug.
Xylazine Sterile Solution Lloyd Laboratories 139-236 10mg/kg. Controlled Drug.
Ethanol Fisher Scientific BP2818100 Dilute to 70% ethanol with water.
21G gauge needle BD Biosciences 305165
Syringe Fisher Scientific 329654 1mL
Operating Scissors World Precision Instruments 501221, 504613 14cm, Sharp/Blunt, Curved and 9 cm, Straight, Fine Sharp Tip
Tweezer Kit World Precision Instruments 504616
-80 ˚C freezer Forma 7240
Spectrum Bessman Tissue Pulverizers Fisher Scientific 08-418-1 Capacity: 10 to 50mg
RNase-free Microfuge Tubes Thermo Fisher Scientific AM12400 1.5 mL
TRIzol Reagent Thermo Fisher Scientific 15596026
Direct-zol RNA MiniPrep Plus Zymo Research R2071
NanoDrop Thermo Fisher Scientific ND-ONE-W
miScript II RT kit Qiagen 218161
Mouse Inflammatory Response & Autoimmunity miRNA PCR Array Qiagen MIMM-105Z
Thin-walled, DNase-free, RNase-free PCR tubes Thermo Fisher Scientific AM12225 for 20 μl reactions
miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control Qiagen 219610
Microsoft Excel Microsoft Corporation https://office.microsoft.com/excel/
Ingenuity Pathway Analysis Qiagen https://www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuity-pathway-analysis/
R Software The R Foundation https://www.r-project.org/
Thermal cycler or chilling/heating block General Lab Supplier
Microcentrifuge General Lab Supplier
Real-time PCR cycler General Lab Supplier
Multichannel pipettor General Lab Supplier
RNA wash buffer Zymo Research R1003-3-48 48 mL
DNA digestion buffer Zymo Research E1010-1-4 4 mL
RNA pre-wash buffer Zymo Research R1020-2-25 25 mL
Ultraviolet ozone analyzer Teledyne API Model T400 http://www.teledyne-api.com/products/oxygen-compound-instruments/t400
Mass flow controllers Sierra Instruments Inc Flobox 951/954 http://www.sierrainstruments.com/products/954p.html

Referanslar

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Bu Makaleden Alıntı Yapın
Fuentes, N., Silveyra, P. Lung microRNA Profiling Across the Estrous Cycle in Ozone-exposed Mice. J. Vis. Exp. (143), e58664, doi:10.3791/58664 (2019).

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