Manipulação optogenetic de circuitos neural durante a monitoração sono/Estados do wakefulness nos ratos

O sono é essencial para a função cognitiva ideal. Achados recentes também sugerem que distúrbios no sono estão associados a uma ampla gama de doenças^1,2,3. Embora as funções do sono sejam ainda largamente não resolvidas, o progresso substancial foi feito recentemente em compreender os circuitos e os mecanismos neural que controlam Estados do sono/vigília⁴. Nos mamíferos, há três Estados de vigilância: vigília, sono não-rápido do movimento de olho (NREM), e sono rápido do movimento de olho (REM). A vigília é caracterizada por oscilações rápidas de EEG (5-12 Hz) de baixa amplitude com atividade motora proposital e sustentada. O sono NREM é definido por oscilações lentas (1-4 Hz) de alta amplitude (ondas delta), com falta de consciência e atividade motora proposital. O sono REM é caracterizado por oscilações relativamente rápidas (6-12 Hz) de baixa amplitude e atonia muscular bilateral quase completa⁵.

Borbely propôs uma teoria da regulação do sono-vigília conhecida como o modelo de dois processos^6,7. Um processo homeostático, também conhecido como processo S, representa a pressão do sono que se acumula durante A vigília e se dissipa durante o sono. Outro processo, referido como processo C, é um processo circadiano, o que explica por que os níveis de vigilância flutuam no ciclo de 24 h. Além desses dois processos, fatores alopáticos também são importantes para a regulação do sono/vigília^8,9. Fatores alopáticos incluem Estados nutricionais e emoção. O medo e a ansiedade geralmente são acompanhados por um aumento da excitação junto com as respostas autonômicas e neuroendócrinas^10,11,12. Acredita-se que o sistema límbico desempenhe um papel na regulação do medo e da ansiedade, e os mecanismos subjacentes às respostas autonômicas e neuroendócrinas têm sido estudados extensivamente, mas o caminho pelo qual o sistema límbico influencia os Estados de sono/vigília não tem ainda foi revelado. Um grande número de estudos recentes usando opto e farmacogenética sugeriram que os neurônios e os circuitos neuronais que regulam os Estados de sono/vigília são distribuídos por todo o cérebro, incluindo os córtices, o forebrain basal, o tálamo, o hipotálamo, e tronco cerebral. Em particular, os recentes avanços na optogenética nos permitiram estimular ou inibir circuitos neurais específicos in vivo com altas resoluções espaciais e temporais. Esta técnica permitirá o progresso em nosso entendimento dos substratos neurais do sono e vigília, e como os Estados de sono/vigília são regulados por processos circadianos, pressão do sono, e fatores alopáticos, incluindo a emoção. Este artigo tem como objetivo apresentar como usar a manipulação optogenética combinada com gravação de sono/vigília, o que poderia ter o potencial de atualizar nossa compreensão dos conectomes e mecanismos no cérebro que desempenham um papel na regulação do sono NREM, sono REM, e vigília. A compreensão deste mecanismo pelo qual o sistema límbico regula os Estados de sono/vigília é de suma importância para a saúde, porque a insônia é geralmente associada com ansiedade ou medo de ser incapaz de dormir (somniphobia).

O BNST é pensado para desempenhar um papel essencial na ansiedade e no medo. Gad 67-expressar os neurônios gabaérgicos são uma grande população do BNST^12,13. Nós examinamos o efeito da manipulação optogenética destes neurônios (GABA^BNST) em Estados do sono/wakefulness. Um dos maiores avanços na neurociência nos últimos anos tem sido métodos que possibilitam a manipulação de neurônios com identidades químicas particulares in vivo, com altas resoluções espaciais e temporais. A optogenética é altamente útil para demonstrar vínculos causais entre a atividade neural e as respostas comportamentais específicas¹⁴. Nós descrevemos o optogenetics como um método para examinar a conectividade funcional de circuitos neural definidos na regulação de Estados do sono/vigília. Utilizando essa técnica, grandes avanços foram alcançados na compreensão dos circuitos neuronais que regulam os Estados de sono/vigília^{15,16,17,18,19} . Em muitos casos, os opsinas são introduzidos especificamente nos neurônios com as identidades químicas particulares em regiões seletivas do cérebro por uma combinação de ratos do CRE-excitador e transferência AAV-negociada CRE-inducible do gene. Mais, a expressão focal de opsinas foto-sensíveis tais como o channelrhodopsin 2 (ChR2)²⁰ ou o archaerhodopsin (archt)²¹ combinados com um sistema de CRE-Loxp ou de FLP-FRT permitem-nos de manipular uma população neuronal seletiva e um específico via neural²².

Nós descrevemos aqui experiências em neurônios GABAergic no BNST como um exemplo. Para expressar opsinas em uma população neuronal designada, os ratos apropriados do excitador de CRE e os vetores CRE-dependentes do vírus são usados o mais freqüentemente. As linhas transgénicas ou de Knock-in em que os opsinas são expressos em populações neuronal particulares são igualmente úteis. Nos experimentos a seguir, utilizamos camundongos Knock-in GAD67-CRE ²³ em que apenas os neurônios gabaérgicos expressam CRE recombinase com um fundo genético C57Bl/6J, e um vetor AAV que contém ChR2 (hChR2 H134R) fundido com eyfp ou eyfp como um controle com um “interruptor FLEx (Flip-excisão)”²⁴. O procedimento descreve especificamente a excitação optogenética de neurônios gabaergic no BNST durante a monitoração de Estados do sono/vigília²⁵.