Özet

Estrutura cristalina do domínio N-terminal do Ryanodine Receptor de Plutella plutella

Published: November 30, 2018
doi:

Özet

Neste artigo, descrevemos os protocolos de determinação de estrutura, purificação, cristalização e expressão da proteína do domínio N-terminal do receptor de ryanodine do diamondback moth (Plutella plutella).

Abstract

Desenvolvimento de inseticidas potentes e eficientes como alvo receptores ryanodine inseto (RyRs) tem sido de grande interesse na área de controle de pragas agrícolas. Até à data, vários insecticidas de diamido visando pragas que ryrs ter sido comercializados, que geram receita anual de 2 bilhões de dólares. Mas a compreensão do modo de ação de inseticidas RyR-direcionamento é limitada pela falta de informações estruturais sobre inseto RyR. Isto por sua vez restringe a compreensão do desenvolvimento da resistência de inseticida em pragas. O diamondback moth (DBM) é uma praga devastadora destruindo crucíferas culturas em todo o mundo, que também tem sido relatada para mostrar resistência aos inseticidas de diamido. Portanto, é de grande importância prática para desenvolver novas inseticidas visando o RyR DBM, especialmente visando uma região diferente do local de ligação do diamido tradicional. Aqui, apresentamos um protocolo para caracterizar estruturalmente o domínio N-terminal do RyR da DBM. A estrutura de cristal de raio-x foi resolvida por substituição molecular em uma resolução de 2.84 Å, que mostra um motivo de dobramento de beta-trevo e uma acompanhamento alfa-hélice. Este protocolo pode ser adaptado para a expressão, purificação e caracterização estrutural de proteínas ou outros domínios em geral.

Introduction

Ryanodine receptors (RyRs) são canais de íon específico, que mediam a permeação dos íons de Ca2 + através das membranas do retículo sarcoplasmático (RS) em células musculares. Portanto, eles jogam um papel importante na processo de acoplamento excitação contração. Na sua forma funcional, RyR monta como um homo-tetrâmero com uma massa molecular de > 2 MDa, com cada subunidade composto por resíduos de aminoácidos ~ 5000. Em mamíferos, existem três isoformas: RyR1 – tipo de músculo esquelético, RyR2 – tipo de músculo cardíaco e RyR3-ubiquitously expressa em tecidos diferentes1.

Em insetos, há apenas um tipo de RyR, que é expresso no tecido muscular e nervoso2. Inseto RyR é mais semelhante a mamíferos RyR2 com uma identidade de sequência de cerca de 47%3. Inseticidas de diamido segmentação RyR de Lepidoptera e Coleoptera foram desenvolvidas e comercializadas por grandes empresas como Bayer (flubendiamida), DuPont (chlorantraniliprole) e Syngenta (cyantraniliprole). Desde o seu lançamento relativamente recente, diamido inseticidas tornaram-se uma das classe mais rápido crescimento de inseticidas. Atualmente, as vendas destes três inseticidas anualmente cruzaram 2 bilhões dólares americanos com uma taxa de crescimento de mais de 50% desde 2009 (Agranova).

Estudos recentes têm relatado o desenvolvimento de resistência em insetos, depois de algumas gerações de uso destes inseticidas4,5,6,7,8. As resistência mutações no domínio transmembrana de RyRs do diamondback moth (DBM), Plutella plutella (G4946E, I4790M) e as posições correspondentes em Minador do tomate, Tuta absoluta (G4903E, I4746M) mostram que a região pode ser envolvido na ligação de inseticida de diamido como esta região é conhecida por ser crítico para retenção do canal4,8,9. Apesar de inúmeras pesquisas nesta área, os mecanismos moleculares exatos de diamido inseticidas permanecem indescritíveis. Além disso, não está claro se as mutações de resistência afetam as interações com diamides diretamente ou qual alostericamente.

Estudos anteriores relataram a estrutura de vários domínios RyR de espécies de mamíferos e a estrutura de completos mamíferos RyR1 e RyR2 por cristalografia de raios x e microscopia cryo-elétron, respectivamente10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 . Mas até agora, nenhuma estrutura de insecto RyR foi relatada, que nos proíbe de compreender os meandros moleculares da função do receptor, bem como os mecanismos moleculares de ação inseticida e desenvolvimento de resistência de inseticida.

Este manuscrito, apresentamos um protocolo de generalizadas para caracterização estrutural de domínio de β-trevo N-terminal do receptor de ryanodine do diamondback moth, uma praga destrutivo infectando crucíferos culturas no mundo22. A construção foi projetada de acordo com o coelho publicado RyR1 NTD cristal estruturas23,24e o cryo-EM modelos estruturais16,17,18,19, 20 , 21. esta é a primeira estrutura de alta resolução, relatada por inseto RyR, que revela o mecanismo de retenção de canal e fornece um modelo importante para o desenvolvimento de inseticidas espécie-específicos usando drogas baseada em estrutura de design. Para a elucidação da estrutura, utilizamos a cristalografia de raios x, que é considerada como o “padrão ouro” para a determinação da estrutura da proteína em perto de resolução atômica. Embora o processo de cristalização é imprevisível e trabalho intensivo, este protocolo passo a passo ajudará pesquisadores a express, purificar e caracterizar outros domínios de inseto RyR ou qualquer outras proteínas em geral.

Protocol

1. Gene clonagem e expressão de proteínas purificação PCR amplificar DNA correspondente à proteína de interesse (resíduos 1-205 de DBM RyR, Genbank ACC. n. AFW97408) e clone em vetor de animal de estimação-28a-HMT por clonagem independente de ligadura (LIC)25. Este vetor contém uma marca de histidina, tag MBP e um local de clivagem de protease TEV no N-terminal15. Projeto LIC primers para amplificação do gene alvo com extens?…

Representative Results

Purificação O domínio N-terminal da DBM RyR foi expressa como uma proteína de fusão com uma marca de hexahistidine, uma marca MBP e um local de clivagem de protease TEV. Nós seguimos uma estratégia de purificação de cinco etapas para obter uma proteína altamente pura, adequada para efeito de cristalização. Em primeiro lugar, a proteína de fusão foi purificada da fracção solúvel de lisado celular por coluna Ni-NTA (…

Discussion

Neste artigo, descrevemos o procedimento para expressar recombinantes, purificar, cristalizar e determinar a estrutura de DBM RyR NTD. Para cristalização, um requisito crucial é a obtenção de proteínas com homogeneidade, pureza e alta solubilidade. Em nosso protocolo, escolhemos usar pET-28a-HMT vetor que contém uma marca de hexahistidine e MBP, ambos os quais poderiam ser utilizados para a purificação obter uma maior pureza de dobra. Além disso, as aids marca MBP na solubilidade da proteína alvo. Nós purific…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Financiamento para esta pesquisa foi fornecida por: nacional chave de pesquisa e desenvolvimento programa de China (2017YFD0201400, 2017YFD0201403), nacional natureza Science Foundation da China (31320103922, 31230061) e projeto de pesquisa básica nacional (973) programa de China (2015CB856500, 2015CB856504). Somos gratos ao pessoal sobre a trajetória de BL17U1 em instalações de radiação síncrotron de Shanghai (SSRF).

Materials

pET-28a-HMT vector This modified pET vector contains a hexahistidine tag, an MBP fusion protein and a TEV protease cleavage site at the N-terminus (Lobo and Van Petegem, 2009)
E. coli BL21 (DE3) strain Novagen 69450-3CN
HisTrapHP column (5 mL) GE Healthcare 45-000-325
Amylose resin column New England Biolabs E8021S
Q Sepharose high-performance column  GE Healthcare 17-1154-01
Amicon concentrators (10 kDa MWCO) Millipore UFC901008
Superdex 200 26/600 gel-filtration column  GE Healthcare 28-9893-36
Automated liquid handling robotic system  Art Robbins Instruments Gryphon
96 Well CrystalQuick Greiner bio-one 82050-494
Uni-Puck Molecular Dimensions MD7-601
Mounted CryoLoop – 20 micron Hampton Research HR4-955
CryoWand Molecular Dimensions MD7-411
Puck dewar loading tool Molecular Dimensions MD7-607
Nano drop Thermo Scientific NanoDrop One
Crystal incubator Molecular Dimensions MD5-605
X-Ray diffractor Rigaku FRX
PCR machine Eppendorf Nexus GX2
Plasmid mini-prep kit Qiagen 27104
Gel extraction kit Qiagen 28704
SspI restriction endonuclease NEB R0132S
T4 DNA polymerase Novagen 2868713
Kanamycin Scientific Chemical 25389940
IPTG Genview 367931
HEPES Genview 7365459
β-mercaptoethanol Genview 60242
Centrifuge Thermo Scientific Sorvall LYNX 6000 
Sonnicator Scientz II-D
Protein purification system GE Healthcare Akta Pure
Light microscope Nikon SMZ745
IzIt crystal dye Hampton Research HR4-710
Electrophoresis unit Bio-Rad 1658005EDU
Shaker Incubator Zhicheng ZWYR-D2401
Index crystal screen Hampton Research HR2-144
Structure crystal screen Molecular Dimensions MD1-01
ProPlex crystal screen Molecular Dimensions MD1-38
PACT premier crystal screen Molecular Dimensions MD1-29
JCSG-plus crystal screen Molecular Dimensions MD1-37

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