Kristalstructuur van de N-terminale domein van Ryanodine Receptor vanaf Plutella xylostella

Ryanodine receptoren (RyRs) zijn specifieke ionenkanalen, die de permeatie van Ca^{2 +} ionen in de membranen van sarcoplasmic reticulum (SR) in spiercellen bemiddelen. Daarom spelen ze een belangrijke rol in de excitatie-contractie koppeling proces. In zijn functionele vorm, assembleert RyR als een homo-tetrameer met een molecuulmassa van > 2 MDa, met elke subeenheid bestaande uit ~ 5000 aminozuurresidu’s. Bij zoogdieren, er zijn drie isoforms: skeletspieren type RyR1 -, RyR2 – type van de hartspier en RyR3-overal uitgedrukt in verschillende weefsels en¹.

Bij insecten is er slechts één soort RyR, die wordt uitgedrukt in spier- en zenuwstelsel weefsel². Insect RyR is meer vergelijkbaar met zoogdieren RyR2 met de identiteit van een reeks van ongeveer 47%³. Diamide insecticiden gericht op RyR van Lepidoptera en kevers zijn ontwikkeld en verkocht door grote bedrijven zoals Bayer (flubendiamide), DuPont (chlorantraniliprole) en Syngenta (cyantraniliprole). Sinds de relatief recente lancering, diamide insecticiden uitgegroeid tot een van de snelst groeiende klasse van insecticiden. Op dit moment hebben de verkoop van deze drie insecticiden jaarlijks 2 miljard Amerikaanse dollars met een groeitempo op jaarbasis van meer dan 50% overschreden sinds 2009 (Agranova).

Recente studies hebben melding gemaakt van resistentie bij insecten na een paar generaties van gebruik van deze insecticiden^4,5,6,7,8. De weerstand mutaties in de transmembrane domein van RyRs vanaf Plutella xylostella (G4946E, I4790M), de koolmot (DBM) en de overeenkomende posities in tomaat trechtervallen, Tuta absoluta (G4903E, I4746M) blijkt dat de regio zou kunnen zijn die betrokken zijn bij diamide insecticide bindend, aangezien deze regio is bekend om zijn cruciaal voor het gating van het kanaal^4,8,9. Ondanks uitgebreid onderzoek op dit gebied blijven de exacte moleculaire mechanismen van diamide insecticiden elusive. Bovendien is het onduidelijk of de weerstand mutaties van invloed zijn op de interacties met diamides direct of allosterically.

Eerdere studies hebben melding gemaakt van de structuur van verschillende RyR domeinen van soorten zoogdieren en de structuur van full-length zoogdieren RyR1 en RyR2 door middel van röntgendiffractie en cryo-elektronenmicroscopie, respectievelijk^{10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21} . Maar tot nu toe geen structuur van insect RyR heeft gemeld, dat verbiedt ons begrip van de moleculaire fijne kneepjes van de receptor functie en de moleculaire mechanismen van insecticide actie en ontwikkeling van insecticide-resistentie.

In dit manuscript presenteren wij een veralgemeende protocol voor de structurele karakterisering van N-terminale β-klaverblad domein van ryanodine receptor van de koolmot, een vernietigende plaag kruisbloemige gewassen wereldwijd²²infecteren. De constructie is ontworpen volgens de gepubliceerde konijn RyR1 NTD crystal structuren^23,24en de cryo-EM structurele modellen^{16,17,18,19, 20 , 21}. Dit is de eerste met een hoge resolutie structuur gerapporteerd voor insect RyR, die onthult het mechanisme voor het kanaal gating en een belangrijke sjabloon voorziet in de ontwikkeling van soortspecifieke insecticiden gebruik structuur gebaseerde drug design. Voor de opheldering van de structuur werkzaam wij middel van röntgendiffractie, die wordt beschouwd als de ‘gouden standaard’ voor eiwit structuurbepaling bij in de buurt van atomaire resolutie. Hoewel de kristallisatie proces onvoorspelbaar en arbeidsintensief is, helpt dit stapsgewijze protocol onderzoekers express, zuiveren en karakteriseren van andere domeinen van insect RyR of elke andere eiwitten in het algemeen.