Aqui, descrevemos um método para a purificação de enzimas pyrophosphokinase histidina-tag e utilizando cromatografia em camada fina dos produtos a ensaiar para a atividade enzimática em vitroe substratos marcadas com radioisótopos. O ensaio da atividade da enzima é amplamente aplicável a quinase, ciclase nucleotídeo ou reação de transferência de fósforo, cujo mecanismo inclui a hidrólise de nucleotídeos trifosfato.
Quinase e pyrophosphokinase enzimas transferir o fosfato gama ou a fracção de pirofosfato de beta-gama de precursores de nucleotídeo trifosfato para substratos para criar produtos fosforilados. O uso de γ –32– P rotulado precursores NTP permite a monitorização simultânea de formação de produto e utilização de substrato por radiografia. Cromatografia em camada fina (TLC) em placas de celulose permite a separação rápida e sensível quantificação do substrato e produto. Apresentamos um método para a utilização da cromatografia de camada fina para analisar a atividade de pyrophosphokinase de uma sintetase de ppGpp purificado (p). Este método anteriormente foi usado para caracterizar a atividade de sintetases nucleotídeo e dinucleótido cíclicas e é amplamente apropriado para caracterizar a atividade de uma enzima que hidrolisa um vínculo de trifosfato de nucleotídeos ou transfere um terminal fosfato de um doador de fosfato para outra molécula.
Quinase e pyrophosphokinase (ou diphospho-quinase) enzimas transferir fosfatos de precursores de nucleotídeo trifosfato (NTP) para as moléculas do substrato. Os substratos podem incluir outros nucleotídeos, aminoácidos ou proteínas, carboidratos e lipídios1. Análises de Bioinformatic às vezes podem prever de uma enzima cognato substrato ou substratos com base na similaridade de enzimas caracterizadas, mas validação experimental ainda é necessária. Da mesma forma, a afinidade de uma enzima para sua substrate(s) e a taxa na qual ele catalisa a reação de transferência de fósforo e os efeitos de co-fatores, inibidores ou outros efetores da enzima devem ser determinado experimentalmente. Para evitar o esgotamento do precursor ATP por outras consumidores de ATP enzimas presentes no citoplasma bacteriana, ensaios de atividade quantitativa exigem proteína purificada.
Purificação de proteínas por cromatografia de afinidade metal tem sido coberta completamente na literatura2,3. Tags de histidina, consistindo de seis resíduos de histidina consecutivos anexados a N – ou C-terminal de uma proteína recombinante permitir rápida purificação por cromatografia de afinidade metal4,5,6. Essas sequências são pequenas em comparação com as proteínas que eles modificar e geralmente têm um efeito mínimo na função da proteína, embora às vezes eles podem alterar a estabilidade da proteína e/ou cinética de enzima7,8. Etiquetas de histidina na N – e C-termini da mesma proteína podem ter efeitos diferentes, que são difíceis de prever sem conhecer a estrutura da proteína em questão. Etiquetas de histidina normalmente são incorporadas durante a clonagem de uma proteína recombinante por projetar primers que codificam seis resíduos de histidina, também imediatamente 3′ para o códon de início ATG ou imediatamente 5′ para o códon de parada do quadro de leitura aberto. Após amplificação, o gene contendo hexahistidine é ligado em um vetor sob o controle de um promotor inducible e expresso, normalmente em um laboratório cepa de e. coli. Então, a proteína de recombinação pode ser isolada em uma resina de afinidade que contém cátions divalentes imobilizado (normalmente níquel ou cobalto)9. Contaminar as proteínas de ligação de metal nativas pode ser removido por titulação com imidazol, que competitivamente desloca limite da proteína2. Finalmente, a proteína alvo é eluída da coluna com concentrações mais altas de imidazol. Existem várias fontes comerciais para resinas de cátion de metal imobilizado, e os fabricantes fornecem recomendações para as condições de reserva e concentrações de imidazol. Após a eluição, proteína pode ser analisada por eletroforese em gel polyacrylamide do sulfato dodecyl de sódio (SDS-PAGE), diálise ou usada imediatamente em ensaios funcionais.
Existem vários métodos para monitorar indiretamente a atividade da quinase pelo acoplamento de hidrólise de ligação de fosfato de ATP para uma segunda reação que libera ou excita um fluoróforo ou gera quimioluminescência, mas estas reações possuem várias partes móveis e podem ser logisticamente desafiadoras10. A maneira mais simples para medir especificamente a atividade de transferência de fósforo é diretamente monitorar a transferência de um grupo fosfato radiolabeled de um γ comercialmente disponível –32-P precursor do NTP para um substrato não-radiolabeled11 , 12 , 13. as misturas de substratos radiolabeled e produtos podem ser separadas e quantificadas por cromatografia de camada fina (TLC). TLC utiliza a mobilidade diferencial de solutos em um determinado solvente, permitindo que o solvente (fase líquida) a migrar por acção capilar através de uma superfície (fase sólida) no qual uma mistura de solutos tem sido adsorvida14. Solutos que são pequenas e/ou faltam de interações favoráveis com a fase contínua irão migrar longas distâncias da sua localização inicial do que solutos com maiores pesos moleculares ou grande afinidade para o sólido. Para exame de transferência de fósforo, metades de fosfato aumentam o peso molecular das moléculas são adicionados a eles e adicionar carga iônica negativa em pH neutro ou ácido11,12,14. Isso diminui sua mobilidade em uma superfície básica como PEI-celulose. Quando desenvolvido em tampão de fosfato ácido de potássio, misturas de mono-, di-, tri-, tetra- e espécies de pentaphosphate podem ser facilmente separadas na PEI-celulose, permitindo a quantificação de cada espécie (Figura 2, Figura 3). Tais ensaios podem ser executados usando lisados celulares contendo a enzima de interesse, mas isso inclui o potencial para a atividade de outros quinases e fosfatases ATPase geral para esgotar o substrato e/ou produto. Para uma avaliação quantitativa em vitro da atividade da enzima, é necessário purificar a enzima de interesse.
Hexaetilo de guanosina (ppGpp) e guanosina pentaphosphate (pppGpp) são ribonucleótido sinalização moléculas formadas pela transferência de um pirofosfato de grupo de um precursor de trifosfato de adenosina (ATP), respectivamente, um guanosina difosfato (PIB) ou guanosina (GTP) de hexaetilo substrato15. Estes sinais ribonucleótido único, coletivamente conhecidos como ppGpp (p), mediam uma resposta de toda a célula ao estresse ambiental, conhecido como a resposta rigorosa em diversas espécies bacterianas15,16. Duas classes conservadas de enzimas catalisam a formação de (p) ppGpp15,17 Rel/Spo homólogo (RSH) enzimas são ‘longo’ bifuncional (p) ppGpp sintetase/hidrolases chamado por sua semelhança com o real e o ponto (p) ppGpp metabólica enzimas de Escherichia coli que contêm sintetase, hidrolase e domínios normativos, enquanto pequenas alarmone sintetase (SAS) enzimas são curto monofuncionais sintetases encontradas exclusivamente no Gram positivo bactérias15, 17 , 18. a bactéria Gram-positiva formadoras de esporos Clostridium difficile codifica putativo RSH e SAS genes19. Aqui, apresentamos os ensaios de atividade inicial que confirmam que a enzima de c. difficile RSH é uma sintetase de ppGpp cataliticamente ativo (p).
Aqui nós relatamos a purificação do RSH com sua Tag de c. difficile e apresentar um método para a quantificação de atividade usando cromatografia em camada fina radiolabeled. Este método foi usado anteriormente para avaliar a atividade das enzimas de ciclase diguanylate de c. difficile, bem como sintetase do ppGpp (p), ciclase de nucleotídeos, quinase e enzimas fosfodiesterase de outros organismos11,12 ,13</…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi financiado pelo NIAID 1K22AI118929-01. EBP foi apoiado por uma bolsa de programa verão Research Fellowship do escritório de pesquisa na Universidade de Old Dominion, Norfolk, Virginia, EUA.
Inducible overexpression of a histidine-tagged protein | |||
Phusion polymerase | New England Biolabs (NEB) | M0530L | |
QIAEX II DNA Gel Extraction Kit | Qiagen | 20021 | |
KpnI restriction enzyme | NEB | R0142S | |
PstI restriction enzyme | NEB | R0140S | |
T4 DNA ligase | NEB | M0202 | |
NEB® 5-alpha Competent E. coli (High Efficiency) | NEB | C2987I | |
BL21 (DE3) Competent E. coli | NEB | C2527I | |
IPTG | Sigma-Aldrich | 10724815001 | |
JXN-26 centrifuge with JLA 10.500 rotor | Beckman Coulter Avanti | – | |
Microcentrifuge with D3024/D3024R rotor | Scilogex | – | |
MaxQ SHKE6000 Incubator | Thermo Scientific | – | |
Ultrasonic processor | Sonics | VC-750 | |
Protein purification by nickel affinity chromatography | |||
Ni-NTA resin | G Biosciences | 786-940/941 | |
Pierce Disposable Gravity columns, 10 mL | Thermo Scientific | 29924 | |
1 mL Spectra/ Por float-A-lyzer G2 dialysis device (MWCO: 20-kD) | Spectrum | G235033 | |
Mini-Protean Electrophoresis Cell | BioRad | 1658004 | |
Protein activity assay by thin layer chromatography | |||
Thin layer chromatograph (TLC) development tank | General Glass Blowing Company | 80-3 | |
Polyethylenimine (PEI)-cellulose plates (20 cm x 20 cm, 100 um thickness) with polyester support | Sigma-Aldrich | Z122882-25EA | |
ATP, [γ-32P]- 3000 Ci/mmol 10mCi/ml lead, 100 μCi | Perkin Elmer | NEG002A | |
Adenosine 5’-triphosphate (ATP) 100 mM | Bio Basic Canada | AB0311 | |
Guanosine-5’-diphosphate disodium salt (GDP) | Alfa Aesar | AAJ61646MC/E | |
Storage phosphor screen | GE Healthcare Life Sciences | BAS-IP TR 2040 E Tritium Screen | |
Storm 860 phosphorimager | GE Healthcare Life Sciences | – |