Een zuivering en In Vitro activiteit Assay voor een (p) ppGpp Synthetase van Clostridium difficile

Kinase en pyrophosphokinase (of diphospho-kinase) enzymen overbrengen fosfaten uit nucleotide trifosfaat (NTP) precursoren substraat moleculen. De substraten kunnen omvatten andere nucleotiden, aminozuren of eiwitten, koolhydraten en vetten¹. Bioinformatic analyses kunnen soms voorspellen van een enzym cognaat substraat of substraten op basis van de gelijkenis met gekarakteriseerd enzymen experimentele validatie is echter nog steeds nodig. Ook de affiniteit van een enzym voor haar substrate(s) en het tarief waartegen het katalyseert de fosfor-overdracht-reactie, en de effecten van cofactoren, remmers, of andere enzym effectoren moeten experimenteel worden bepaald. Kwantitatieve activiteit testen vereisen om te voorkomen dat de uitputting van de voorloper van de ATP door andere ATP-verbruikende enzymen aanwezig in bacteriële cytoplasma, gezuiverde eiwit.

Eiwitreiniging door metalen affiniteitchromatografie is grondig gecoverd in de literatuur^2,3. Histidine tags bestaande uit zes opeenvolgende histidine residuen toegevoegd aan de N – of C-terminus van een recombinant eiwit toestaan snelle zuivering door metal affinity chromatografie^4,5,6. Deze sequenties zijn klein in vergelijking met de eiwitten ze wijzigen en hebben meestal een minimaal effect op eiwitfunctie, hoewel ze soms eiwitstabiliteit en/of enzyme kinetics^7,8kunnen wijzigen. Histidine tags op de N – en C-termini van hetzelfde eiwit kunnen verschillende gevolgen hebben, die moeilijk te voorspellen, zonder de structuur van het eiwit in kwestie. Histidine tags zijn meestal tijdens het klonen van een recombinant eiwit door het ontwerpen van inleidingen die zes histidine residuen, ofwel onmiddellijk coderen 3′ aan de ATG start codon of onmiddellijk 5′ naar de stop codon van het open leesraam opgenomen. Na versterking, is het gen hexahistidine-bevattende afgebonden in een vector onder de controle van een afleidbare promotor en uitgedrukt, meestal in een laboratorium stam van E. coli. Het eiwit recombinatie kan vervolgens worden geïsoleerd op een hars van de affiniteit met daarin geïmmobiliseerdet divalente kationen (meestal nikkel of kobalt)⁹. Besmetting van inheemse metaal-bindende proteïnen kan worden verwijderd door titratie met imidazool, die concurrerend afhankelijke eiwitten^{2 verdringt}. Ten slotte is het doel eiwit uit de kolom met hogere concentraties van imidazool geëlueerd. Er zijn verschillende commerciële bronnen voor geïmmobiliseerdet metalen catie harsen en de fabrikanten bieden aanbevelingen voor de buffer voorwaarden en imidazol concentraties. Na elutie, kan eiwit worden geanalyseerd door natrium dodecyl sulfaat-polyacrylamide gelelektroforese (SDS-pagina), dialyzed of onmiddellijk gebruikt in functionele testen.

Er zijn verschillende methoden om niet indirect kinaseactiviteit controleren door de hydrolyse van ATP fosfaat bond koppelen aan een tweede reactie die loslaat of een fluorophore opwekt of Chemoluminescentie genereert, maar deze reacties hebben meerdere bewegende delen en kan logistiek uitdagende¹⁰. De eenvoudigste manier om te meten specifiek fosfor-overdracht activiteit is rechtstreeks volgen de overdracht van een radiolabeled fosfaatgroep van een commercieel beschikbare γ –³²-P NTP voorloper van een niet-radiolabeled substraat^{11 , 12 , 13}. mengsels van radiolabeled substraten en producten kunnen worden gescheiden en gekwantificeerd door de dunne laag chromatografie (TLC). TLC maakt gebruik van de differentiële mobiliteit van opgeloste stoffen in een bepaald oplosmiddel doordat het oplosmiddel (vloeibare fase) migreren door capillaire actie over een oppervlak (vaste fase) waarop een mengsel van opgeloste stoffen geadsorbeerde¹⁴is geweest. Opgeloste stoffen die zijn klein en/of gebrek aan gunstige interactie met de vaste fase zal migreren langere afstanden vanaf hun oorspronkelijke locatie dan opgeloste stoffen met een hoger molecuulgewicht of grote affiniteit voor de vaste stof. Voor de bestudering van fosfor-overdracht, fosfaat wordt verhoogd het molecuulgewicht van moleculen ze worden toegevoegd aan, en voeg negatieve Ionische lading aan neutrale of zure pH^11,12,14. Dit vermindert hun mobiliteit op een fundamentele oppervlak zoals PEI-gemengd met cellulose. Wanneer ontwikkeld in zure kalium fosfaatbuffer, kunnen de mengsels van mono-, di-, tri-, tetra- en pentaphosphate soorten gemakkelijk worden gescheiden op PEI-cellulose, waardoor kwantificering van elke soort (Figuur 2, figuur 3). Dergelijke tests kunnen worden uitgevoerd met behulp van cel lysates met het enzym van belang, maar hierbij het potentieel voor de activiteit van andere kinases, fosfatasen genaamd, en algemene ATPasen aan het uitputten van het substraat en/of product. Een kwantitatieve in vitro beoordelingvan enzymactiviteit is het noodzakelijk voor het zuiveren van het enzym van belang.

Calciumguanosine tetraphosphate (ppGpp) en calciumguanosine pentaphosphate (pppGpp) zijn ribonucleotide signalering moleculen gevormd door de overdracht van een pyrofosfaat groep uit een voorloper van adenosinetrifosfaat (ATP) aan, respectievelijk, een calciumguanosine difosfaat (BBP) of calciumguanosine tetraphosphate (GTP) substraat¹⁵. Deze interne ribonucleotide signalen, gezamenlijk bekend als (p) ppGpp, bemiddelen een cel-brede reactie op milieudruk bekend als de strenge reactie in verschillende bacteriesoorten^15,16. Twee geconserveerde klassen van enzymen katalyseren de vorming van (p) ppGpp^15,17 Rel/Spo homolog (RSH) enzymen zijn ‘lang’ bifunctionele (p) ppGpp synthetase/hydrolases is vernoemd naar hun gelijkenis met de EXTE en SpoT (p) ppGpp metabole enzymen van Escherichia coli die bevatten synthetase, hydrolase en regelgevende domeinen, terwijl kleine alarmone synthetase (SAS) enzymen korte monofunctional synthetases gevonden uitsluitend in Gram positieve bacteriën^15, zijn ^{17 , 18}. de spore-vormende gram-positieve bacterie Clostridium difficile codeert putatief RSH en SAS genen¹⁹. Hier presenteren we testen van de eerste activiteit die bevestigen dat de C. difficile RSH-enzym een catalytically actieve (p) ppGpp synthetase is.