Bursal 전염병 바이러스 병 인을 공부 하는 Ex Vivo 닭 기본 Bursal 세포 배양 모델

동물 들과 함께 모든 절차 승인 되어야 합니다 윤리적으로 사전에. 우리의 기관에 모든 절차는 내부 동물 복지 및 윤리 검토 위원회 (AWERB)의 승인 후 홈 오피스 설립, 개인 및 프로젝트 라이선스에서 영국 동물 (과학적인 절차) 행위 1986에 따라 수행 됩니다. 1입니다. chCD40L의 준비 안정적으로 수용 성 chCD40L을 표현 하는 문화 HEK 293-msCD8-CD40L 셀 송아지 태아 혈 청 (FCS) 및 5%를 포함 하는 분위기에서 37 ° C에서 1 µ g/mL puromycin 로스웰 파크 기념 연구소 (RPMI) 매체 10% 열 비활성화 보완 (안녕하세요) x 1에 생성 CO 2.참고: 이러한 셀 다음 적절 한 자료 전송 계약에 서명 하는 Pirbright 연구소에서 사용할 수 있습니다. 1:5 밀도 confluent 때 셀을 분할 합니다. 수집 (수용 성 chCD40L 구문이 포함) 상쾌한 때마다 셀 분할 세포질 파편을 제거 하 고 4 ° c.에 그것을 저장 하는 5 분에 대 한 400 x g 에서 원심 상쾌한의 500 mL를 수집 하는 때 액체 수영장 하 고 필터-소독 그것 0.2 µ m 필터를 통해. 제조업체의 지침에 따라 10 K의 분자 무게 컷오프와 원심 단백질 집중 장치를 사용 하 여 상쾌한 집중. 각 열에서 집중된 상쾌한을 추출 하 고, 함께 수영장 필터-소독 그것 0.22 μ m 주사기 필터를 통해 그것을 전달 하 여. 직렬 1에서 chCD40L 솔루션을 희석 하 여 실험에 사용 될 최종 농도 결정 x Iscove의 Dulbecco의 매체 (IMDM) (에서 설명한 단계 2.4)와 희석 존재 자란 기본 bursal 셀 수정. 최대 1 주일 동안 매일 세포의 수와 백분율 생존 능력을 결정 합니다.참고: 세포 증식과 생존 능력은 적절 한 최저 농도 분석 결과에 사용 하 여 농도가 이다. 이 1시 20분, 1시 50분 사이 있을 것입니다. 2. 치킨 기본 Bursal 셀 격리 솔루션의 준비 살 균 H2O의 0.47 90 mL에 Ca와 10 x HBBS의 10 mL를 추가 하 여 칼슘 (Ca) 행 크 스 균형된 소금 솔루션 (HBBS) x 1을 준비 7.5% NaHCO3의 µ L. 0.2 µ M 필터를 통해 Ca. 필터를 소독을 1 x HBBS에서 8 mg/mL에서 콜라 D 재고 솔루션 솔루션을 준비 합니다.참고: 그것은 5 mL aliquots를 준비 하 고-20 ° c.에서 그들을 멈추게 하는 것이 좋습니다. 1 준비 x RPMI 매체 보충 5% 안녕하세요 FCS. 4 ° c.에 미디어를 저장 준비 1 x 500 mL IMDM의 보충 8% 안녕하세요 FCS, 2% 안녕하세요 닭 혈 청, β-mercaptoethanol 50 m m, 50 µ L 인슐린-처리가-나트륨-selenite, 및 1% 페니실린/스. 4 ° c.에 미디어를 저장참고: 위에서 언급 한 모든 솔루션을 사전에 준비 합니다. 1 x HBBS Ca. 저장소와 얼음에 솔루션을 준비 합니다. 살 균 H2O, 7.5% NaHCO3, 0.47 µ L EDTA 10 m m의 최종 농도에 90 mL에 Ca 없이 10 x HBBS의 10 mL를 추가 하 여 Ca 없이 1 x HBBS를 준비 합니다. 얼음에 솔루션을 저장 합니다. 18 mL의 총 수 있도록 Ca와 HBBS의 13 ml 콜라 D 재고 솔루션의 5 mL을 추가 하 여 1 x 콜라 D 솔루션을 준비 합니다. 얼음에 솔루션을 저장 합니다.참고: 실험의 하루에 2.5-2.7 단계에서 언급 한 솔루션을 준비 합니다. 3. 부르사의 파 (BF)의 제거 후면 및 해치 닭 적절 한, 승인 된 시설에 고통 없이 나이의 2-3 주에 따.참고: 학살에 대 한 연구소 승인 메서드를 사용 합니다. 무 균 기술을 사용 하 여 각 치킨에서 BF를 수집 합니다.참고: 프로토콜을 사용 하 여 기관에 장소에. 등 recumbency에 시체를 놓고 소독 피부 및 깃털 70% 에탄올, 물에 희석의 솔루션으로는 복 부와 흉부를 오버레이 합니다. 멸 균된 메스 또는 위를 사용 하 여 더 낮은 복 부에 복 부 정중 선 절 개를 확인 합니다. 두개골은 cloaca 콜론의 꼬리 부분에 연결 된 부르사의 파를 찾습니다. 소독된 집게와가 위, 콜론에서 부르사의 파를 잘라 사용 합니다. 용기를 puncturing 하지 않도록 주의 하십시오. 차가운 PBS에 장기를 놓고 얼음에 실험실으로 전송 합니다.참고: 기본 셀 장기 수확 후 즉시 격리 해야 합니다. 4입니다. 닭 기본 Bursal 셀의 격리 BF 적어도 3 세척 미생물 안전 캐비닛에서 일하고 차가운 PBS의 30 mL에 x. 조직 배양 접시 (지름, 높이 21 m m 92 mm)을 전송 하 고 1 x 콜라 D 솔루션의 5 mL를 추가 합니다. 살 균가 위 또는 BF 직경에서 5 m m 미만의 조각으로 잘라 메스 블레이드를 사용 합니다. 30 분에 대 한 정기적인 부드러운 동요와 37 ° C에서 조직 품 어.참고: 콜라 솔루션 조직 소화 시작 됩니다. 조직의 해체를 장려 하기 위해 혼합물을 발음 반복 살 균 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여. 필요한 경우 조직을 작은 조각으로 잘라. 조직에 1 x 콜라 D 솔루션의 또 다른 5 mL을 추가 하 고 또 다른 30 분에 대 한 정기적인 부드러운 동요와 37 ° C에서 품 어. 조직을 완전히 소화 될 때까지 4.6-4.7 단계를 반복 합니다.참고: 있을 것입니다 더 이상 분해 되지 않는 작은 알갱이. 세포 현 탁 액을 Ca 없이 1 x HBBS의 20 mL로 100 µ m 셀 여과기에 통과. 셀 서 스 펜 션 5 분에 대 한 400 x g 에서 원심 삭제는 상쾌한 고 1의 10 mL에 펠 릿을 resuspend x RPMI 5 s. Polysucrose와 나트륨 diatrizoate를 포함 하는 밀도 그라데이션 미디어의 5 mL 위에 세포 현 탁 액 10 mL를 오버레이 또는 10 mL 세포 현 탁 액 아래 밀도 그라데이션 미디어의 5 mL 언더레이. 거기 2 사이 명확한 인터페이스 인지 확인 합니다. 900 x g 4 ° c.에 20 분에 오버레이 원심 낮은 또는 원심 브레이크를 제거 합니다.참고: 셀 셀 미디어와 밀도 그라데이션 미디어 간의 인터페이스에 밴드를 형성 한다. 살 균 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 셀을 제거 하 고 차가운 PBS에 넣어. 3 세포를 씻어 x 400 x g 5 분에 centrifuging와 차가운 PBS에 그들을 resuspending. 5입니다. 닭 기본 Bursal 세포의 문화 400 x g 5 분 동안에 세포 현 탁 액을 원심 하 고 완전 한 IMDM x 1에서 그들을 resuspend. 세포 현 탁 액의 약 수를 받아, Trypan 블루 솔루션에 추가 하 고 Trypan 블루 제외 가능한 셀의 수를 계산. 백분율 생존 세포의 수를 결정 합니다. 400 x g 5 분 동안에 세포 현 탁 액을 원심과 1시 20분으로 보완 하는 완전 한 IMDM에 resuspend 1 x 107 셀/mL의 조밀도에 치킨 CD40L의 희석. 결정은 범위 1시 10분 ~ 1시 50분에 최적의 희석 chCD40L를 포함 하는 집중된 상쾌한 적정 48-72 h. U 바닥 96 잘 접시 바닥 접시 보다는 37 ° C에 96-24 잘 접시 중에 셀 문화.참고: 셀 40 ° C에서 경작 될 수 있다 또한 6. 닭 기본 Bursal 셀 IBDV의 감염 48-72 h 후 절연, 바이러스, 소용돌이 샘플의 약 수를 녹여 하 고 얼음에 저장 합니다. Resuspend 기본 bursal 셀 10 µ L 셀 서 스 펜 션의 aliquot 걸릴, Trypan 블루 솔루션의 10 µ L을 추가 하 고 셀 및 백분율 가능성의 수를 결정. 바이러스 감염 (MOI) 수 있도록 바이러스 inoculum 소용돌이의 적절 한 다중성을 완전 한 IMDM x 1에 희석. 셀 서 스 펜 션 5 분에 대 한 400 x g 에서 원심 상쾌한을 제거 하 고 바이러스 inoculum 셀 resuspend. 정기적인 동요와 1 시간 동안 37 ° C에 세포 현 탁 액을 품 어. 400 x g 5 분 동안에 세포 현 탁 액을 원심, 바이러스 inoculum을 제거 하 고 완전 한 IMDM 미디어 x 1에 있는 셀을 씻어. 400 x g 5 분 동안에 세포 현 탁 액을 원심, 상쾌한, 제거 하 고 닭고기 CD40L mL 당 1 x 107 세포의 밀도와 보완 하는 완전 한 IMDM 미디어 셀 resuspend. 37 ° c.에 96-또는 24-잘 접시 중에 셀 문화참고: 셀 40 ° C에서 경작 될 수 있다 또한 7. 닭 기본 Bursal 셀에 IBDV 복제의 정량화 원하는 시간 포인트 바람직합니다에 셀 resuspend, 적절 한 튜브에 그들을 전송, 5 분에 대 한 400 x g 에서 원심 고 수확 바이러스 적정에 대 한 상쾌한 패 분석 결과 또는 리드 Muench 당 TCID50 분석 결과 방법15. PBS의 1 mL에 세포를 씻어와 IBDV, 특정 항 체와 immunostaining에 대 한 준비 또는 RNA (제조업체의 지침에 따라) 적절 한 키트를 사용 하 여 추출 및 수행 반전 녹음 방송 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (RT-정량) 사용 하 여 뇌관 (앞으로, GAGGTGGCCGACCTCAACT; IBDV 유전자에 대 한 특정 리버스, GCCCGGATTATGTCTTTGAAG)입니다. 모의 감염 된 세포 배양 컨트롤으로 사용 되어야 한다.