原发性鸡初囊-细胞培养模型研究传染性囊内病病毒发病机制

所有与动物有关的程序必须事先得到伦理上的批准。在我们的机构, 所有程序都按照《英国动物 (科学程序) 法》 (1986) 在内政部设立、个人和项目许可的情况下执行, 经内部动物福利和道德审查委员会 (AWERB) 批准。 1. chCD40L 的制备 培养 HEK 293-msCD8-CD40L 细胞, 稳定地表达在1x 罗斯威尔公园纪念研究所 (RPMI) 培养基中的可溶性 chCD40L 结构, 辅以10% 热灭活 (hi) 胎小牛血清 (FCS) 和1µg/毫升嘌呤霉素37°c 的大气中含有 5% CO2。注: 在签署适当的物质转让协议后, Pirbright 研究所可获得这些细胞。 汇合时, 将细胞分成1:5 密度。收集上清 (含可溶性 chCD40L 构造) 每次细胞分裂, 离心 400 x g 5 分钟, 以去除细胞碎片, 并存储在4摄氏度。 当500毫升的上清已收集, 池的液体和过滤-消毒它通过一个0.2 µm 过滤器。 根据制造商的说明, 使用离心蛋白浓缩器将上清液浓缩为 10 K 的分子重量截止。从每一柱上提取浓缩的清液, 将其聚集在一起, 通过0.22 µm 注射器过滤器将其消毒。 确定在实验中使用的最终浓度, 通过连续稀释 1x Iscove 修饰 Dulbecco 培养基 (IMDM) 中的 chCD40L 溶液 (在步骤2.4 中描述), 并在稀释存在的情况下培养初级法氏囊细胞。确定每个单元的数量和百分比, 每天最多一周。注意: 细胞增殖和生存能力足够的最低浓度是在化验中使用的浓度。这可能是介于1:20 和1:50 之间。 2. 鸡初囊室分离液的制备 用钙 (ca) 加入10毫升的 10x HBBS, 在90毫升的不育 H2O 和0.47 µL 7.5% NaHCO3的情况下, 制备1x 汉克斯的平衡盐溶液 (HBBS)。 用8毫克/毫升在 1x HBBS 中制备胶原酶, 用 Ca 过滤-通过0.2 µM 过滤器消毒溶液。注: 最好准备5毫升整除数, 并将其冻结在-20 摄氏度。 准备 1x RPMI 培养基辅以5% 喜 FCS。将介质存储在摄氏4摄氏度。 准备 1x 500 毫升的 IMDM 补充与 8% hi FCS, 2% 喜鸡血清, 50 毫米β巯基乙醇, 50 µL 胰岛素转铁蛋白-亚硒酸钠, 1% 青霉素/链霉素。将介质存储在摄氏4摄氏度。注: 事先准备好上述解决方案。 准备 1x HBBS 与 Ca. 在冰上储存溶液。 在不含钙的情况下, 加入10毫升 10x HBBS, 不含 ca 到90毫升的无菌 H2O, 0.47 µL 7.5% NaHCO3, HBBS, 并在最终浓度为10毫米的 EDTA 上制备1x。把溶液储存在冰上。 将5毫升胶原酶的溶液添加到13毫升的 HBBS 中, 用 Ca 制备1x 胶原酶溶液, 共18毫升。把溶液储存在冰上。注: 在实验当天准备步骤2.5–2.7 中提到的解决方案。 3. 清除 (BF) 囊 后方和孵化鸡在一个适当的, 批准的设施和人道地剔除他们在2–3周的年龄。注: 使用研究所批准的剔除方法。 使用无菌技术收集每只鸡的 BF。注: 使用机构中的协议。 将胴体置于背卧床, 并对腹部和胸腔覆盖的皮肤和羽毛进行消毒, 溶液中有70% 乙醇, 稀释在水中。 用灭菌的手术刀或剪刀在下腹部做腹中线切口。 定位的囊腔, 这是连接到骶部的结肠, 颅骨到泄殖腔。 使用灭菌的镊子和剪刀, 切开无结肠的法氏囊。注意避免刺穿内脏。 把风琴放在冷 PBS 里, 把它转移到实验室冰上。注意: 在器官收割后应尽快隔离原细胞。 4. 鸡初囊细胞的分离 在微生物安全柜中工作, 在30毫升的冷 PBS 中至少清洗高炉3x。 将组织转移到培养皿 (直径92毫米, 高度21毫米), 并加入5毫升的1x 胶原酶 D 溶液。 使用无菌剪刀或手术刀刀片, 将 BF 切成直径小于5毫米的碎片。 以周期性温和搅拌30分钟的37摄氏度孵育组织。注: 胶原酶溶液将开始消化组织。 使用无菌的巴斯德吸管, 反复吸入混合物, 以鼓励组织的解体。如有必要, 将组织切成小块。 添加另5毫升的1x 胶原酶 D 溶液的组织和孵化它在37°c 与周期性的温和搅拌, 另30分钟。 重复步骤4.6 和 4.7, 直到组织完全消化。注: 将有小颗粒, 不会进一步溶解。 通过细胞悬浮通过100µm 细胞过滤器到20毫升 1x HBBS 没有钙。 离心机细胞悬浮在 400 x g为5分钟。 在10毫升的 1x RPMI 与5% 的 FCS 中, 丢弃上清和并用重悬颗粒。 要么覆盖10毫升的细胞悬浮在5毫升的密度梯度介质上含有聚蔗糖和钠葡或衬底5毫升密度梯度介质10毫升细胞悬浮。确保两者之间有明确的接口。 离心机覆盖在 900 x g 20 分钟在4摄氏度。降低或拆卸离心机断裂。注: 细胞应在细胞介质与密度梯度介质之间的界面形成一个波段。 使用无菌的巴斯德吸管, 取出细胞并放置在寒冷的 PBS。通过离心 400 x g 5 分钟, 并 resuspending 在冷 PBS 中, 洗涤细胞3x。 5. 鸡初囊细胞培养 离心机的细胞悬浮在 400 x g 5 分钟, 并并用重悬他们在1x 完整的 IMDM。 整除细胞悬浮液, 将其加入到台盼蓝溶液中, 并计算排除台盼蓝的可行细胞数。确定单元格数和生存率百分比。 离心机细胞悬浮在 400 x g为5分钟和并用重悬它在完全 IMDM 补充以1:20 稀释鸡 CD40L 在密度 1 x 107个细胞/毫升。滴定含有 chCD40L 的浓缩清液, 以确定最佳稀释度, 这很可能位于1:10 到1:50 的范围内。 培养 96-或24井板的细胞在37°c 为 48–72 h. U 底96井板比平底板材优选。注: 细胞也可以培养在40°c 6. IBDV 鸡初囊细胞感染 48–72 h 后隔离, 解冻整除的病毒, 漩涡的样本, 并储存在冰上。 并用重悬主要的法氏囊细胞, 采取10µL 整除的细胞悬浮, 添加到10µL 的台盼蓝溶液, 并确定细胞数量和百分比的可行性。 稀释病毒在1x 完全 IMDM 到适当的感染多样性 (语言), 使病毒接种和漩涡。 离心机细胞悬浮在 400 x g为5分钟。 取出上清, 并用重悬病毒接种中的细胞。 将细胞悬浮在37摄氏度时孵育为1小时, 周期性搅拌。 离心机的细胞悬浮在 400 x g 5 分钟, 删除病毒接种, 并清洗细胞在1x 完整的 IMDM 媒体。 离心细胞悬浮在 400 x g为5分钟, 去除上清, 并且并用重悬细胞在完全 IMDM 媒介补充与鸡 CD40L 在密度 1 x 107个细胞每毫升。 培养细胞在96或24井板在37°c。注: 细胞也可以培养在40°c 7. 鸡初囊细胞 IBDV 复制的量化研究 在需要的时间点感染后, 并用重悬细胞, 转移他们到适当的管, 离心他们在 400 x g为5分钟和收获上清为病毒滴定法由斑块化验或 TCID50化验作为每芦苇-明奇方法15。 清洗1毫升 PBS 中的细胞, 并准备他们为染色与特定的抗体 IBDV, 或提取 RNA 使用适当的试剂盒 (按照制造商的指示) 和执行反向转录定量聚合酶链反应 (RT-qPCR) 用底漆特异的 IBDV 基因 (向前, GAGGTGGCCGACCTCAACT;反转, GCCCGGATTATGTCTTTGAAG)。模拟感染的细胞培养应作为一种控制。