Microdiálisis de aminoácidos excitatorios durante las grabaciones de EEG en mover libremente las ratas

Para proporcionar la penetración en la debilitación funcional de mediada por glutamato excitatoria y la neurotransmisión inhibitoria GABAérgica resultando en convulsiones espontáneas en epilepsia de lóbulo temporal (ELT), supervisamos sistemáticamente las concentraciones extracelulares de GABA¹ y más adelante los niveles de glutamato y aspartato² por microdiálisis en el hipocampo ventral de ratas en varios momentos de la enfermedad natural curso, es decir, durante el desarrollo y progresión de la epilepsia. Tomamos ventaja del TLE pilocarpina modelo en ratas, que imita la enfermedad con mucha precisión en términos de cambios conductuales, electrofisiológico e histopatológico^3,4 y correlacionamos la concentración del dializado de amino ácidos a sus diferentes fases: la fase aguda tras el insulto epileptogénica, la fase de latencia, el tiempo de la primera convulsión espontánea y la crónica phass^5,6,7. Enmarcando las fases de la enfermedad fue habilitado por la supervisión del vídeo-EEG a largo plazo y la precisa EEG y caracterización clínica de las convulsiones espontáneas. Aplicación de la técnica de microdiálisis asociada a monitoreo video-EEG a largo plazo nos permitió proponer hipótesis mecanicistas de neuropatología TLE. En Resumen, la técnica descrita en este manuscrito permite el apareamiento de alteraciones neuroquímicas dentro de un área definida del cerebro con el desarrollo y progresión de la epilepsia en un modelo animal.

Dispositivos emparejados, formados por un electrodo de profundidad yuxtapuesto con una cánula de microdiálisis, a menudo se emplean en estudios de investigación de epilepsia donde cambios en los neurotransmisores y sus metabolitos, sustratos de energía deben ser correlacionados con la actividad neuronal. En la mayoría de los casos, se utiliza en comportarse libremente los animales, pero puede realizarse también de forma similar en los seres humanos, por ejemplo, en pacientes epilépticos fármaco-resistentes sometidos a investigación de electrodos de profundidad antes de la cirugía⁸. Grabación de EEG y recogida del dializado pueden realizarse por separado (por ejemplo, implantar el electrodo en un hemisferio y la microdiálisis la sonda en el otro hemisferio o incluso realizar el microdialysis en un grupo de animales mientras se realiza el EEG único en otro grupo de animales). Sin embargo, los electrodos de acoplamiento a las sondas puede tener múltiples ventajas: simplifica la cirugía estereotáctica, limita el daño a los tejidos a un sólo hemisferio (dejando la otra intacta, como un control para los estudios histológicos) y homogeneiza los resultados como estos se obtienen de la misma región del cerebro y el mismo animal.

Por otro lado, la preparación del dispositivo juntado microdialysis sonda electrodo requiere habilidades y tiempo si es hecho en casa. Uno podría pasar relativamente altas cantidades de dinero si comprado en el mercado. Por otra parte, cuando sondas de microdiálisis (puntas de prueba son típicamente 200-400 μm de diámetro y 7-12 mm de largo)⁹y los electrodos de EEG (puntas de los electrodos suelen ser de 300-500 μm de diámetro y el tiempo suficiente para llegar a la estructura cerebral de interés¹⁰) son junto, el dispositivo montado representa un objeto relativamente pesado y voluminoso en un lado de la cabeza, que es molesto para los animales y propensa a perder sobre todo cuando está conectado a la bomba de diálisis y el sistema de grabación de EEG de alambre duro. Este aspecto es más relevante en animales epilépticos que son difíciles de manejar y menos adaptables a las sesiones de microdiálisis. Las técnicas quirúrgicas adecuadas y cuidados postoperatorios adecuados pueden resultar en implantes de larga duración que causan mínimas molestias animales y deben ser perseguidos para experimentos de microdiálisis combinatoria-EEG^{10,11, 12}.

Las ventajas y limitaciones de la técnica de microdiálisis han sido revisados en detalle por muchos neurocientíficos. Su principal ventaja sobre otras en vivo perfusión técnicas (p. ej., flujo rápido de vaivén o perfusión cortical Copa) es un pequeño diámetro de la sonda que cubre un área relativamente preciso de interés^{13,14, 15}. En segundo lugar, la membrana de microdiálisis crea una barrera física entre el tejido y la solución; por lo tanto, sustancias de molecularidad elevada del peso no se cruzan y no interfieren con el análisis de^16,17. Por otra parte, el tejido está protegido por el flujo turbulento de la solución¹⁸. Otra ventaja importante es la posibilidad de modificar el flujo de la solución para maximizar la concentración de analito en la solución (es decir, el proceso de microdiálisis pueden ser definido matemáticamente y puede ser modificado para alto rendimiento concentraciones del analito en la muestra)¹⁹. Por último, la técnica puede usarse para infundir los fármacos o sustancias farmacológicamente activas en los tejidos de interés y determinar su efecto en el sitio de intervención²⁰. Por otro lado, microdiálisis tiene un tiempo de resolución limitada (típicamente más de 1 minuto por el tiempo necesario para recoger muestras) en comparación con los sensores electroquímicos o biológicos; es una técnica invasiva que causa daño a los tejidos; compromete el equilibrio neuroquímico en el espacio alrededor de la membrana debido al gradiente de concentración continua de todas las sustancias solubles que entra en la solución con el analito de interés. Por último, la técnica de microdiálisis está altamente influenciada por los límites de las técnicas analíticas empleadas para la cuantificación de sustancias en la solución^9,21,22,23 . La cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) después de la derivatización con orthophthaldialdehyde para el análisis de glutamato y aspartato en muestras biológicas ha sido bien validado^{24,25,26 , 27} y su amplia discusión está fuera del alcance de este manuscrito, pero los datos producidos mediante este método se describirá en detalle.

Cuando se realiza correctamente y sin modificaciones de la composición de la solución, microdialysis puede proporcionar información confiable sobre los niveles basales de la liberación de neurotransmisor. La mayor parte de los niveles básicos es probablemente el resultado del derrame de transmisor de la sinapsis⁹. Porque en muchos casos el muestreo simple del neurotransmisor en el espacio sináptico extra no es suficiente para perseguir los objetivos de la investigación, la técnica de microdiálisis se puede emplear también para estimular las neuronas o a privarlos de importantes fisiológicos iones como K⁺ o Ca^{2 +}, con el fin de evocar o evitar la liberación del neurotransmisor.

Alta estimulación de K⁺ se utiliza a menudo en Neurobiología para estimular la actividad neuronal en animales despiertos, pero también en culturas primarias y organotypic. La exposición de un saludable del sistema nervioso central a las soluciones con altas concentraciones de K⁺ (40-100 mM) evoca la emanación de neurotransmisores²⁸. Esta capacidad de las neuronas para proporcionar una versión adicional en respuesta a la alta K⁺ puede verse comprometida en animales epilépticos¹ y en otras neurodegenerativas enfermedades^29,30. Asimismo, el Ca^{2 +} privación (obtenida por perfundiendo soluciones libres de Ca^{2 +} ) se utiliza para establecer dependiente de calcio liberación de más neurotransmisores medidos por microdiálisis. Generalmente se cree que el comunicado dependiente de Ca^{2 +} es de origen neuronal, mientras que sala independiente de Ca^{2 +} origina de glia, pero muchos estudios levantado controversia sobre el significado de Ca^{2 +}-medidas sensibles de p. ej. glutamato o GABA⁹: así, si es posible, es recomendable para apoyar estudios de microdiálisis microsensor estudios, ya que estos últimos tienen mayor resolución espacial y los electrodos permite acercarse a las sinapsis³¹.

Con respecto a los estudios de microdiálisis en animales epilépticos, es importante destacar que los datos obtenidos de la mayoría de ellos dependen de video o video-EEG monitoreo de asimientos, es decir, de la ocurrencia transitoria de signos o síntomas debido a la anormal excesiva o sincrónica actividad neuronal en el cerebro de³². Hay algunos detalles de asimientos electrográficos en animales de pilocarpina tratado que deben considerarse al preparar el experimento. Convulsiones espontáneas son seguidas por la deprimida actividad con frecuentes puntos interictales de EEG³ y ocurren en racimos^33,34. Sham operados no epilépticos animales pueden exhibir actividad de asimiento-como³⁵ y por lo tanto los parámetros para la evaluación de las grabaciones de EEG deben ser estandarizado³⁶ y, si es posible, debe ser bien definido el calendario de sesiones de microdiálisis. Por último, le recomendamos siguiendo los principios y normas metodológicas para la supervisión del vídeo-EEG en roedores adultos control descrito por los expertos de la Liga Internacional contra la epilepsia y sociedad americana de la epilepsia en sus recientes informes^{37 ,38}.

Aquí, describimos la microdiálisis de glutamato y aspartato en paralelo con las grabaciones de vídeo-EEG a largo plazo en animales epilépticos y su análisis en el dializado por HPLC. Haremos hincapié en los pasos críticos del protocolo que se debe cuidar para mejor resultado.