Microdialysis של חומצות אמינו מעוררות במהלך ההקלטות EEG בחופשיות העברת חולדות

כדי לספק תובנות תיפקודי של גלוטמט בתיווך שליחים של GABAergic עצבית מעכבות וכתוצאה מכך להתקפים ספונטנית אפילפסיה של האונה הרקתית (TLE), אנחנו באופן שיטתי פיקוח ריכוזי חוץ-תאית גאבא¹ ו מאוחר יותר הרמות של גלוטמט אספרטט² באמצעות microdialysis בהיפוקמפוס הגחון של חולדות בנקודות שונות בזמן-של המחלה הטבעית כמובן, קרי, במהלך פיתוח והתקדמות של אפילפסיה. לקחנו יתרון של TLE פילוקרפין דגם בחולדות, אשר מחקה את המחלה באופן מדויק מבחינת שינויים התנהגותיים, אלקטרופיזיולוגיות, histopathological^3,4 , אנחנו בקורלציה dialysate ריכוז אמינו חומצות כדי שלה שלבים שונים: השלב חריפה לאחר העלבון epileptogenic, שלב החביון, זמנם של ההתקף הראשון ספונטנית ו^6,5,7phass כרונית. מסגור את שלבי המחלה היה מופעל על ידי ניטור וידאו EEG לטווח ארוך, EEG מדויק, איפיון קליני של התקפים ספונטנית. היישום של השיטה microdialysis המשויכת לטווח ארוך ניטור וידאו EEG מאפשרת לנו להציע השערות מכניסטית TLE neuropathology. לסיכום, בטכניקה המתוארת בכתב יד זה מאפשר הזיווג של שינויים עצבית בתוך אזור המוח מוגדר עם פיתוח, התקדמות של אפילפסיה במודל חיה.

התקנים לזווג, המורכב של אלקטרודה עומק juxtaposed כדי בצינורית microdialysis, מועסקים לעיתים קרובות בלימודי מחקר אפילפסיה שבו שינויים עצביים, שלהם מטבוליטים או אנרגיה מצעים צריכים להיות בקורלציה פעילות. עצבית. ברוב המכריע של המקרים, זה נמצא בשימוש בחיות מתנהגות באופן חופשי, אך זה יכול להתבצע גם בצורה דומה בבני אדם, למשל, בקרב חולי אפילפסיה טוהר הפרמה קופ עמידים לעומק החקירה אלקטרודה לפני הניתוח⁸. EEG הקלטה וגם אוסף dialysate יכול להתבצע בנפרד (למשל, השתלת האלקטרודה באונה אחת, את microdialysis בדיקה ההמיספרה השנייה או אפילו ביצוע את microdialysis בקבוצה אחת של בעלי חיים בעת ביצוע הבלעדית EEG בקבוצה אחרת של בעלי חיים). עם זאת, צימוד האלקטרודות כדי הגששים ייתכן יתרונות מרובים: זה מפשט את ניתוח stereotaxic, מגביל את רקמת נזק באונה אחת בלבד (תוך השארת האחר, ללא פגע, כפקד ללימודי היסטולוגית), ו homogenizes את תוצאות כמו אלה מתקבלים באותו האזור במוח, אותה חיה.

מצד שני, הכנת המכשיר בדיקה-אלקטרודה microdialysis בשילוב דורש מיומנויות זמן אם זה תוצרת בית. אחד לבזבז סכומי כסף גבוהים יחסית אם רכשת מהשוק. יתר על כן, כאשר microdialysis רגשים (בדיקה טיפים הם בדרך כלל 200-400 מיקרומטר קוטר ו 7-12 מ מ אורך)⁹ו אלקטרודות EEG (אלקטרודה טיפים בדרך כלל של 300-500 מיקרומטר בקוטר, מספיק זמן כדי להגיע את מבנה המוח של ריבית¹⁰)? יחד, המכשיר הנטען מייצגת אובייקט מגושם וכבד יחסית בצד אחד של הראש, וזה בעייתי לבעלי ונוטים להיות איבדה במיוחד כאשר הוא מחובר המשאבה דיאליזה ומערכת הקלטה EEG קווית. היבט זה רלוונטי יותר בבעלי אפילפטי קשה לטפל, פחות גמישים לפגישות microdialysis. טכניקות ניתוחיות נכונה וטיפול לאחר הניתוח המתאים יכול לגרום השתלים לאורך זמן לגרום אי נוחות מינימלית בעלי חיים, צריך להיות נרדף עבור ניסויים combinatory microdialysis EEG^{10,11, 12}.

היתרונות ואת המגבלות של הטכניקה microdialysis נבדקו בפירוט בידי מדעני מוח רבים. היתרון העיקרי שלו על פני ויוו זלוף טכניקות אחרות (למשל, זרימה מהירה מו-דו או גביע קורטיקלית זלוף) היא בקוטר קטן של המכשיר אשר משתרע על שטח יחסית מדויק של עניין^{13,14, 15}. שנית, קרום microdialysis יוצר מכשול פיסי בין הרקמות של perfusate; לכן, משקל מולקולרי גבוה חומרים לא לחצות, אל תתערבו עם ניתוח ה-^16,17. יתר על כן, הרקמה מוגן מפני הזרם מערבולות perfusate¹⁸. יתרון חשוב נוסף הוא האפשרות לשנות את זרימת perfusate עבור למקסם את ריכוז analyte perfusate (קרי, התהליך של microdialysis יכולות ובכן להגדיר באופן מתמטי, ניתן לשנות להניב תשואה גבוהה ריכוזי analyte המדגם)¹⁹. לבסוף, ניתן להשתמש בטכניקה כדי להשרות את תרופות או חומרים פעילים פרמקולוגית לתוך הרקמה עניין וכדי לקבוע את ההשפעה שלהם באתר של התערבות²⁰. מצד שני, microdialysis יש זמן מוגבל רזולוציה (בדרך כלל יותר מ 1 דקות בשל הזמן הנדרש לאיסוף דגימות) בהשוואה חיישנים ביולוגיים או אלקטרוכימי; זו טכניקה פולשנית הגורמת נזק לרקמות; זה פוגע את האיזון עצבית בתוך המרחב סביב הקרום עקב מעבר הצבע ריכוז רציפה של כל חומרים מסיסים אשר מזין את perfusate יחד עם analyte עניין. לבסוף, הטכניקה microdialysis מאוד מושפע ממגבלות שיטות אנליטיות מועסק כימות של חומרים perfusate^9,21,22,23 . כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים (HPLC) לאחר derivatization עם orthophthaldialdehyde עבור ניתוח גלוטמט אספרטט בדגימות ביולוגיות טוב המאומת^{24,25,26 , 27} ו שלה דיון נרחב מתוך הטווח של כתב יד זה, אך הנתונים הופק באמצעות שיטה זו יתוארו בפרוטרוט.

כאשר מבוצעת כראוי וללא שינויים של ההרכב perfusate, microdialysis יכול לספק מידע אמין על רמות הבסיס של שחרור נוירוטרנסמיטר. החלק הגדול ביותר של רמות הבסיס הוא כנראה התוצאה של העודפים המשדר הסינפסות⁹. כי במקרים רבים דגימה פשוטה של הנוירוטרנסמיטר בחלל תוספת סינפטית אינה מספיקה לרדוף אחר המטרות של חקירה, הטכניקה microdialysis יכול להיות גם מועסק כדי לעורר את הנוירונים או כדי לשלול מהם חשוב יונים פיזיולוגיים כגון K⁺ או Ca^{2 +}, על מנת לעורר או למנוע את שחרור הנוירוטרנסמיטר.

גירוי K⁺ גבוהה משמש לעיתים קרובות מצאו כדי לעורר פעילות. עצבית לא רק בבעלי חיים ערה, אלא גם בתרבויות ראשי ו organotypic. החשיפה של מערכת העצבים המרכזית בריאה לפתרונות עם ריכוזים גבוהים של K⁺ (40-100 מ מ) מעורר את בזרימת של נוירוטרנסמיטורים²⁸. יכולת זו של נוירונים לספק שחרור נוסף בתגובה גבוהה K⁺ אולי התגלה באפילפטיים חיות¹ וב –^29,אחרים מחלות ניווניות³⁰. באופן דומה, ה-Ca^{2 +} מניעת (מתקבל על ידי פרפוזיה Ca^{2 +} פתרונות חינם) משמש ליצירת סידן תלוית שחרור של מרבית הנוירוטרנסמיטרים נמדדת microdialysis. בדרך כלל הוא האמין כי Ca^{2 +} התלויים שחרור הוא ממוצא עצביים, ואילו Ca^{2 +} עצמאית שחרור מקורו עכשיו, דונלד, אך מחקרים רבים העלו מחלוקת על המשמעות של Ca^{2 +}-מדידות רגיש למשל גלוטמט או GABA⁹: לפיכך, במידת האפשר, רצוי לתמוך microdialysis מחקרים עם לימודי microsensor, כמו אלה האחרונים יש רזולוציה מרחבית גבוהה יותר ומאפשר האלקטרודות כדי להתקרב הסינפסות³¹.

בנוגע microdialysis מחקרים בבעלי חיים אפילפטי, חשוב להדגיש כי הנתונים המתקבלים רובם להסתמך על וידאו או וידאו EEG ניטור של התקפים, קרי, ההתרחשות ארעית של סימנים או תסמינים בשל חריגה סינכרוני או יתר פעילות. עצבית את המוח³². יש קצת פרטים של התקפים electrographic בבעלי פילוקרפין מטופלים אשר יש לקחת בחשבון בעת הכנת הניסוי. התקפים ספונטנית ולאחריו פעילות מדוכא עם EEG תכופים קוצים interictal³ , מתרחשים באשכולות^33,34. חיות-אפילפטי המופעלים המזויפים עשוי להפגין הפציינט³⁵ ולכן הפרמטרים להערכה הקלטות EEG צריך להיות מתוקנן³⁶ ו, במידת האפשר, התזמון של הפעלות microdialysis צריכה להיות מוגדרת היטב. לבסוף, אנו ממליצים בחום בעקבות עקרונות ותקנים מתודולוגי עבור ניטור וידאו EEG בחולדות למבוגרים שליטה המתוארים על ידי מומחים של הליגה הבינלאומית נגד אפילפסיה, החברה האמריקאית אפילפסיה בדוחות שלהם לאחרונה^{37 ,38}.

כאן, אנו מתארים microdialysis ושל גלוטמט אספרטט במקביל הקלטות וידאו EEG לטווח ארוך בבעלי חיים אפילפטי וניתוח שלהם dialysate על ידי HPLC. יושם דגש על השלבים הקריטיים של פרוטוקול אחד צריך לדאוג לקבלת התוצאה הטובה ביותר.