Здесь мы представляем протокол для генетических включение L-Диоксифенилаланин biosynthesized от простых исходных материалов и его применение к белка спряжение.
L-Диоксифенилаланин (ДОПЫ) это аминокислота, в биосинтезе катехоламинов в животных и растений. Из-за его особую биохимические свойства аминокислота имеет несколько использует в биохимических приложений. Этот доклад описывает протокол для генетических включение biosynthesized ДОПЫ и его применение к белка спряжение. ДОПЫ biosynthesized, тирозин фенол лиазы (TPL) от катехол, пируват и аммиака, аминокислота является непосредственно включена и белков методом генетической включения с использованием и развивались аминоацил тРНК аминоацил тРНК синтетазы пара. Это прямое включение системы эффективно включает ДОПЫ с маленькой включение других природных аминокислот и лучше белок доходность, чем предыдущие системы генетических включения для ДОПЫ. Белка конъюгации с ДОПЫ содержащих белков является эффективным и конкретным участкам и показывает свою полезность для различных приложений. Этот протокол обеспечивает белка ученых с подробные процедуры для осуществления эффективного биосинтеза мутантных белков, содержащих ДОПЫ на желаемых сайты и их сопряжения для промышленности и фармацевтической.
ДОПЫ это аминокислота участвует в биосинтезе катехоламинов в животных и растений. Эта аминокислота от Tyr синтезируется гидроксилазы тирозин и молекулярного кислорода (O2)1. Потому что ДОПЫ прекурсор допамина и может проникать blood – brain барьер, он был использован в лечении болезни Паркинсона-2. ДОПЫ встречается также в мидий адгезии белков (карты), которые отвечают за адгезионные свойства мидии в влажных условиях3,4,5,6,7. Tyr сначала кодируется в позициях, где ДОПЫ находится в карты и затем преобразуется в ДОПЫ tyrosinases8,9. Из-за его интересные биохимические свойства ДОПЫ был использован в различных приложениях. Dihydroxyl группы ДОПЫ химически подвержен окислению, и аминокислоты легко превращается в L-допаквинон, предшественник Меланины. Благодаря своей высокой electrophilicity L-допаквинон и его производные, были использованы для сшивки и конъюгации с тиолами и амины10,11,12,13. 1,2-хиноны также может функционировать как диеновых для реакции циклоприсоединения и были использованы для bioconjugation штамм способствует окислению контролируется cyclooctyne-1,2-хиноны (SPOCQ) циклоприсоединения14. Кроме того группа dihydroxyl может хелатной ионов металлов Fe3 + и Cu2 +, и белки, содержащие ДОПЫ были использованы для доставки лекарств и Ион металла, зондирования15,16.
ДОПЫ генетически включены в белки с использованием ортогональных аминоацил тРНК (aa тРНК) и аминоацил тРНК синтетазы (Орсе) пары17 и используется для белка спряжение и сшивки10,11, 12,13. В настоящем докладе описаны результаты экспериментов и протоколы для генетических включение ДОПЫ biosynthesized от дешевых исходных материалов и ее применения для bioconjugation. ДОПЫ-biosynthesized с помощью ТПЛ и начиная от катехол, пируват и аммиака в Escherichia coli. Biosynthesized ДОПЫ непосредственно включены в белки, выразив развивались пару aa тРНК и Орсе для ДОПЫ. Кроме того белок biosynthesized, содержащие ДОПЫ site-specifically конъюгированных с флуоресцентного зонда и высокоструктурированные производить белок олигомеров. Этот протокол будет полезным для белка ученых, biosynthesize мутантных белков, содержащих ДОПЫ и конъюгат белки с биохимическими зондов или препаратов для фармацевтической и промышленных приложений.
В этом протоколе биосинтез и прямое включение ДОПЫ описаны. Бактериальные клетки, используемые в этом методе можно синтезировать дополнительные аминокислоты и использовать его как неестественный строительный блок для синтеза белка. Генетическая включение неестественные аминокисло?…
The authors have nothing to disclose.
Это исследование было поддержано глобальной программы исследований границы (СР 2015M3A6A8065833), и основные программы исследований науки (2018R1A6A1A03024940) через Национальный фонд исследований Кореи (NRF) финансируется правительством Кореи.
1. Plasmid Construction | |||
Plasmid pBAD-dual-TPL-GFP-E90TAG | optionally contain the amber stop codon(TAG) at a desired position. Ko, W. et al. Efficient and Site-Specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-Alkyne Cycloaddition. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015) | ||
Plasmid pEvol-DHPRS2 | 1. Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., and Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010) 2. Kim, S., Sung, B. H., Kim, S. C., Lee, H. S. Genetic incorporation of l-dihydroxyphenylalanine (DOPA) biosynthesized by a tyrosine phenol-lyase. Chem. Commun. 54 (24), 3002-3005, doi: 10.1039/c8cc00281a (2018). | ||
DH10β | Invitrogen | C6400-03 | Expression Host |
Plasmid Mini-prep kit | Nucleogen | 5112 | 200/pack |
Agarose | Intron biotechnology | 32034 | 500 g |
Ethidium bromide | Alfa Aesar | L07482 | 1 g |
LB Broth | BD Difco | 244620 | 500 g |
2. Culture preparation | |||
2.1) Electroporation | |||
Micro pulser | BIO-RAD | 165-2100 | |
Micro pulser cuvette | BIO-RAD | 165-2089 | 0.1 cm electrode gap, pkg. of 50 |
Ampicillin Sodium | Wako | 018-10372 | 25 g |
Chloramphenicol | Alfa Aesar | B20841 | 25 g |
Agar | SAMCHUN | 214230 | 500 g |
SOC medium | Sigma | S1797 | 100 mL |
3. Expression and Purification of GFP-E90DOPA by biosynthetic system | |||
3.1 Expression of GFP-E90DOPA by biosynthetic system | |||
L(+)-Arabinose, 99% | Acros | 104981000 | 100 g |
Pyrocatechol, 99% | SAMCHUN | P1387 | 25 g |
Ammonium sulfate, 99% | SAMCHUN | A0943 | 500 g |
pyruvic acid, 98% | Alfa Aesar | A13875 | 100 g |
Sodium phosphate dibasic, anhydrous, 99% | SAMCHUN | S0891 | 1 kg |
Potassium phophate, monobasic, 99% | SAMCHUN | P1127 | 1 kg |
Magnesium sulfate, anhydrous, 99% | SAMCHUN | M0146 | 1 kg |
D(+)-Glucose, anhydrous, 99% | SAMCHUN | D0092 | 500 g |
Glycerol, 99% | SAMCHUN | G0269 | 1 kg |
Trace metal mix a5 with co | Sigma | 92949 | 25 mL |
L-Proline, 99% | SAMCHUN | P1257 | 25 g |
L-Phenylalanine, 98.5% | SAMCHUN | P1982 | 25 g |
L-Tryptophane | JUNSEI | 49550-0310 | 25 g |
L-Arginine, 98% | SAMCHUN | A1149 | 25 g |
L-Glutamine, 98% | JUNSEI | 27340-0310 | 25 g |
L-Asparagine monohydrate, 99% | SAMCHUN | A1198 | 25 g |
L-Methionine | JUNSEI | 73190-0410 | 25 g |
L-Histidine hydrochloride monohydrate, 99% | SAMCHUN | H0604 | 25 g |
L-Threonine, 99% | SAMCHUN | T2938 | 25 g |
L-Leucine | JUNSEI | 87070-0310 | 25 g |
Glycine, 99% | SAMCHUN | G0286 | 25 g |
L-Glutamic acid, 99% | SAMCHUN | G0233 | 25 g |
L-Alanine, 99% | SAMCHUN | A1543 | 25 g |
L-Isoleucine, 99% | SAMCHUN | I1049 | 25 g |
L-Valine, 99% | SAMCHUN | V0088 | 25 g |
L-Serine | SAMCHUN | S2447 | 25 g |
L-Aspartic acid | SAMCHUN | A1205 | 25 g |
L-Lysine monohydrochloride, 99% | SAMCHUN | L0592 | 25 g |
3.2 Cell lysis | |||
Imidazole, 99% | SAMCHUN | I0578 | 1kg |
Sodium phosphate monobasic, 98% | SAMCHUN | S0919 | 1 kg |
Sodium Chloride, 99% | SAMCHUN | S2907 | 1 kg |
Ultrasonic Processor – 150 microliters to 150 milliliters | SONIC & MATERIALS | VCX130 | |
3.3 Ni-NTA Affinity Chromatography | |||
Ni-NTA resin | QIAGEN | 30210 | 25 mL |
Polypropylene column | QIAGEN | 34924 | 50/pack, 1 mL capacity |
4. Oligomerization of Purified GFP-E90DOPA | |||
Sodium periodate, 99.8& | Acros | 419610050 | 5 g |
5. Conjugation of GFP-E90DOPA with an Alkyne Probe by Strain-Promoted Oxidation-Controlled Cyclooctyne–1,2-Quinone Cycloaddition (SPOCQ) | |||
Cy5.5-ADIBO | FutureChem | FC-6119 | 1mg |
6. Purification of Labeled GFP | |||
Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters | MILLIPORE | UFC500396 | 96/pack, 500ul capacity |
7. SDS-PAGE Analysis and Fluorescence Gel Scanning | |||
1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5 % | Sigma | 10708984001 | 10 g |
NuPAGE LDS Sample Buffer, 4X | Thermofisher | NP0007 | 10 mL |
MES running buffer | Thermofisher | NP0002 | 500 mL |
Nupage Novex 4-12% SDS PAGE gels | Thermofisher | NO0321 | 12 well |
Coomassie Brilliant Blue R-250 | Wako | 031-17922 | 25 g |
G:BOX Chemi Fluorescent & Chemiluminescent Imaging System | Syngene | G BOX Chemi XT4 | |
8. MALDI-TOF MS analysis by Trypsin Digestion | |||
8.1 Preparation of the digested peptide sample by trypsin digestion | |||
Tris(hydroxymethyl)aminomethane, 99% | SAMCHUN | T1351 | 500 g |
Hydrochloric acid, 35~37% | SAMCHUN | H0256 | 500 mL |
Dodecyl sulfate sodium salt, 85% | SAMCHUN | D1070 | 250 g |
Iodoacetamide | Sigma | I6125 | 5 g |
Trypsin Protease, MS Grade | Thermofisher | 90057 | 5 x 20 µg/pack |
C-18 spin columns | Thermofisher | 89870 | 25/pack, 200 µL capacity |
8.2 Analysis of the digested peptide by MALDI-TOF | |||
Acetonitirile, 99.5% | SAMCHUN | A0125 | 500 mL |
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma | C2020 | 10 g |
Trifluoroacetic acid, 99% | SAMCHUN | T1666 | 100 g |
MTP 384 target plate ground steel BC targets | Bruker | 8280784 | |
Bruker Autoflex Speed MALDI-TOF mass spectrometer | Bruker |