כאן, אנו מציגים עבור שיתוף L-dihydroxyphenylalanine biosynthesized מחומרים פשוטים המוצא הגנטי ויישומו חלבון ההטיה פרוטוקול.
L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) היא חומצת אמינו נמצאו ביוסינטזה של catecholamines, בעלי חיים וצמחים. בשל תכונותיו הביוכימי מסוים, חומצת אמינו ביותר יש שימושים מרובות יישומים ביוכימיים. הדו ח מתאר פרוטוקול עבור שיתוף גנטי biosynthesized DOPA ויישומו חלבון ההטיה. DOPA היא biosynthesized על-ידי טירוזין פנול-lyase (TPL) catechol, פירובט, אמוניה, חומצת אמינו ביותר מעוגנת ישירות לחלבונים בשיטת התאגדות גנטי באמצעות aminoacyl מפותחת-tRNA וזוג המעביר aminoacyl-tRNA. מערכת ישירה התאגדות זו משלבת ביעילות DOPA התאגדות הקטן של חומצות אמינו טבעיות אחרות, עם התשואה חלבון טוב יותר מאשר מערכת גנטית התאגדות הקודם עבור DOPA. ההטיה חלבון עם DOPA המכילים חלבונים הם יעילים גם בייעודי לאתר ויראה תועלתו ליישומים שונים. פרוטוקול זה מספק חלבון למדענים הליכים מפורטים ביוסינתזה יעיל של מוטציה חלבונים המכילים DOPA האתרים המבוקשים, ההטיה שלהם עבור יישומים תעשייתיים ובתחום הרוקחות.
DOPA היא חומצת אמינו מעורב ביוסינטזה של catecholamines, בעלי חיים וצמחים. זו חומצת אמינו הוא מסונתז מן Tyr טירוזין hydroxylase, חמצן מולקולרי (O2)1. כי DOPA הוא סימן מקדים של דופמין, יכולים לחדור את מחסום דם – מוח, זה נעשה שימוש בטיפול של מחלת פרקינסון2. DOPA נמצא גם חלבונים אדהזיה מאסל (מפות), אשר אחראים על המאפיינים דבק של מולים ב התנאים הרטובים3,4,5,6,7. Tyr מקודד בתחילה על העמדות איפה DOPA הוא נמצא במפות, ואז מומר DOPA ב8,tyrosinases9. בשל תכונותיו הביוכימי מעניין, DOPA השתמשו במגוון רחב של יישומים. קבוצת dihydroxyl DOPA כימית נוטה ל, חומצת אמינו ביותר מומר בקלות L-dopaquinone, סימן מקדים של melanins. בגלל electrophilicity גבוהה שלה, L-dopaquinone ונגזרותיו שימשו crosslinking, ההטיה עם תיולים ו אמינים10,11,12,13. 1, 2-קווינונס יכול לפעול גם diene לתגובות cycloaddition, שימשו bioconjugation על ידי קידום-זן שבשליטת חמצון cyclooctyne-1, 2-quinone (SPOCQ) cycloaddition14. בנוסף, הקבוצה dihydroxyl יכול chelate יונים מתכתיים כגון Fe3 + ו- Cu2 +, כבר מנוצל חלבונים המכילים DOPA עבור משלוח סמים ויון מתכת חישה15,16.
יש כבר שולב חלבונים על-ידי שימוש aminoacyl-tRNA אורתוגונלית (aa-tRNA), ו aminoacyl-סינתזת המעביר (aaRS) זוג17 ונועד לשמש חלבון ההטיה, crosslinking10,11, גנטית DOPA 12,13. בדו ח זה, מתוארות תוצאות ניסויית ופרוטוקולים כהכנה לסיפוח DOPA biosynthesized של חומרי המוצא זול ושימושיה bioconjugation גנטית. DOPA הוא biosynthesized באמצעות TPL ו החל מ- catechol פירובט, אמוניה ב- Escherichia coli. Biosynthesized DOPA הוא ישירות שולב חלבונים על ידי הבעת זוג aa-tRNA, aaRS מפותחת עבור DOPA. בנוסף, החלבון biosynthesized המכיל DOPA הוא site-specifically מצומדת עם בדיקה פלורסנט, תפור לייצר חלבון oligomers. פרוטוקול זה להיות שימושי עבור מדענים חלבונים, חלבונים מוטציה biosynthesize המכיל DOPA, נזווג את החלבונים עם הגששים ביוכימי או סמים עבור יישומים תעשייתיים ובתחום הרוקחות.
ב פרוטוקול זה, מתוארים ביוסינטזה של ישיר תיאגוד DOPA. לתא חיידקי שנמצא בשימוש בשיטה זו יכול לסנתז חומצה אמינית נוספים ולהשתמש בו בתור הבניין לא טבעי סינתזה של חלבון. שילוב גנטי של חומצות אמינו לא טבעי כבר טכנולוגיה המפתח לפיתוח אורגניזם לא טבעי עם קוד גנטי המורחב. עם זאת, שיטה זו כבר שלם מבחינ…
The authors have nothing to disclose.
מחקר זה נתמך על ידי תוכנית מחקר הכללית הגבול (ה-NRF-2015M3A6A8065833), יסוד מדע מחקר התוכנית (2018R1A6A1A03024940) דרך לאומי מחקר קרן של קוריאה (ב- NRF) ממומן על ידי ממשלת קוריאה.
1. Plasmid Construction | |||
Plasmid pBAD-dual-TPL-GFP-E90TAG | optionally contain the amber stop codon(TAG) at a desired position. Ko, W. et al. Efficient and Site-Specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-Alkyne Cycloaddition. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015) | ||
Plasmid pEvol-DHPRS2 | 1. Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., and Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010) 2. Kim, S., Sung, B. H., Kim, S. C., Lee, H. S. Genetic incorporation of l-dihydroxyphenylalanine (DOPA) biosynthesized by a tyrosine phenol-lyase. Chem. Commun. 54 (24), 3002-3005, doi: 10.1039/c8cc00281a (2018). | ||
DH10β | Invitrogen | C6400-03 | Expression Host |
Plasmid Mini-prep kit | Nucleogen | 5112 | 200/pack |
Agarose | Intron biotechnology | 32034 | 500 g |
Ethidium bromide | Alfa Aesar | L07482 | 1 g |
LB Broth | BD Difco | 244620 | 500 g |
2. Culture preparation | |||
2.1) Electroporation | |||
Micro pulser | BIO-RAD | 165-2100 | |
Micro pulser cuvette | BIO-RAD | 165-2089 | 0.1 cm electrode gap, pkg. of 50 |
Ampicillin Sodium | Wako | 018-10372 | 25 g |
Chloramphenicol | Alfa Aesar | B20841 | 25 g |
Agar | SAMCHUN | 214230 | 500 g |
SOC medium | Sigma | S1797 | 100 mL |
3. Expression and Purification of GFP-E90DOPA by biosynthetic system | |||
3.1 Expression of GFP-E90DOPA by biosynthetic system | |||
L(+)-Arabinose, 99% | Acros | 104981000 | 100 g |
Pyrocatechol, 99% | SAMCHUN | P1387 | 25 g |
Ammonium sulfate, 99% | SAMCHUN | A0943 | 500 g |
pyruvic acid, 98% | Alfa Aesar | A13875 | 100 g |
Sodium phosphate dibasic, anhydrous, 99% | SAMCHUN | S0891 | 1 kg |
Potassium phophate, monobasic, 99% | SAMCHUN | P1127 | 1 kg |
Magnesium sulfate, anhydrous, 99% | SAMCHUN | M0146 | 1 kg |
D(+)-Glucose, anhydrous, 99% | SAMCHUN | D0092 | 500 g |
Glycerol, 99% | SAMCHUN | G0269 | 1 kg |
Trace metal mix a5 with co | Sigma | 92949 | 25 mL |
L-Proline, 99% | SAMCHUN | P1257 | 25 g |
L-Phenylalanine, 98.5% | SAMCHUN | P1982 | 25 g |
L-Tryptophane | JUNSEI | 49550-0310 | 25 g |
L-Arginine, 98% | SAMCHUN | A1149 | 25 g |
L-Glutamine, 98% | JUNSEI | 27340-0310 | 25 g |
L-Asparagine monohydrate, 99% | SAMCHUN | A1198 | 25 g |
L-Methionine | JUNSEI | 73190-0410 | 25 g |
L-Histidine hydrochloride monohydrate, 99% | SAMCHUN | H0604 | 25 g |
L-Threonine, 99% | SAMCHUN | T2938 | 25 g |
L-Leucine | JUNSEI | 87070-0310 | 25 g |
Glycine, 99% | SAMCHUN | G0286 | 25 g |
L-Glutamic acid, 99% | SAMCHUN | G0233 | 25 g |
L-Alanine, 99% | SAMCHUN | A1543 | 25 g |
L-Isoleucine, 99% | SAMCHUN | I1049 | 25 g |
L-Valine, 99% | SAMCHUN | V0088 | 25 g |
L-Serine | SAMCHUN | S2447 | 25 g |
L-Aspartic acid | SAMCHUN | A1205 | 25 g |
L-Lysine monohydrochloride, 99% | SAMCHUN | L0592 | 25 g |
3.2 Cell lysis | |||
Imidazole, 99% | SAMCHUN | I0578 | 1kg |
Sodium phosphate monobasic, 98% | SAMCHUN | S0919 | 1 kg |
Sodium Chloride, 99% | SAMCHUN | S2907 | 1 kg |
Ultrasonic Processor – 150 microliters to 150 milliliters | SONIC & MATERIALS | VCX130 | |
3.3 Ni-NTA Affinity Chromatography | |||
Ni-NTA resin | QIAGEN | 30210 | 25 mL |
Polypropylene column | QIAGEN | 34924 | 50/pack, 1 mL capacity |
4. Oligomerization of Purified GFP-E90DOPA | |||
Sodium periodate, 99.8& | Acros | 419610050 | 5 g |
5. Conjugation of GFP-E90DOPA with an Alkyne Probe by Strain-Promoted Oxidation-Controlled Cyclooctyne–1,2-Quinone Cycloaddition (SPOCQ) | |||
Cy5.5-ADIBO | FutureChem | FC-6119 | 1mg |
6. Purification of Labeled GFP | |||
Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters | MILLIPORE | UFC500396 | 96/pack, 500ul capacity |
7. SDS-PAGE Analysis and Fluorescence Gel Scanning | |||
1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5 % | Sigma | 10708984001 | 10 g |
NuPAGE LDS Sample Buffer, 4X | Thermofisher | NP0007 | 10 mL |
MES running buffer | Thermofisher | NP0002 | 500 mL |
Nupage Novex 4-12% SDS PAGE gels | Thermofisher | NO0321 | 12 well |
Coomassie Brilliant Blue R-250 | Wako | 031-17922 | 25 g |
G:BOX Chemi Fluorescent & Chemiluminescent Imaging System | Syngene | G BOX Chemi XT4 | |
8. MALDI-TOF MS analysis by Trypsin Digestion | |||
8.1 Preparation of the digested peptide sample by trypsin digestion | |||
Tris(hydroxymethyl)aminomethane, 99% | SAMCHUN | T1351 | 500 g |
Hydrochloric acid, 35~37% | SAMCHUN | H0256 | 500 mL |
Dodecyl sulfate sodium salt, 85% | SAMCHUN | D1070 | 250 g |
Iodoacetamide | Sigma | I6125 | 5 g |
Trypsin Protease, MS Grade | Thermofisher | 90057 | 5 x 20 µg/pack |
C-18 spin columns | Thermofisher | 89870 | 25/pack, 200 µL capacity |
8.2 Analysis of the digested peptide by MALDI-TOF | |||
Acetonitirile, 99.5% | SAMCHUN | A0125 | 500 mL |
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma | C2020 | 10 g |
Trifluoroacetic acid, 99% | SAMCHUN | T1666 | 100 g |
MTP 384 target plate ground steel BC targets | Bruker | 8280784 | |
Bruker Autoflex Speed MALDI-TOF mass spectrometer | Bruker |